2. 加入 150 ml ZymoPURE ™ P2(蓝色),立即轻轻颠倒试管 6 次混匀。不要涡旋!室温下放置 3-5 分钟 3。当溶液呈清澈、紫色且粘稠时,表示细胞完全裂解。 3. 加入 150 ml ZymoPURE ™ P3(黄色),轻轻颠倒试管但彻底混匀。不要涡旋!样品完全变黄后再颠倒试管 5 次。中和完成时,样品将变黄,并形成淡黄色沉淀。 4. 将 ZymoPURE ™ Giga Filter 放在 33 mm 或 45 mm 颈玻璃瓶上,并将裂解物装入 ZymoPURE ™ Giga Filter 中。确保 ZymoPURE ™ Giga Filter 牢固地放在玻璃瓶顶部,等待 10 分钟让沉淀浮到顶部。 5. 将 ZymoPURE ™ Giga 过滤器连接到真空源并打开真空 4 直到回收约 375 ml 澄清的裂解物。保存澄清的裂解物!从千兆过滤器中回收约 375 ml 的裂解物对于下一步至关重要。如果澄清的裂解物体积低于约 375 ml,请参阅附录第 10 页有关调整步骤 6 中使用的 ZymoPURE™ 结合缓冲液体积的信息。
d. 将培养板放入 37 C 培养箱中并孵育 10 分钟。每 3-4 分钟轻轻摇晃培养板一次有助于完全分离细胞。 e. 加入 1 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基,并轻轻吹打细胞直至 iPSC 完全分离。 f. 计数细胞,并将 1.0 3 10 4 –1.5 3 10 4 个细胞接种到 iMatrix 涂层的 6 孔板中,该板含有 2 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基,如步骤 cg 中所述,将细胞在 37 C 的 CO 2 培养箱中孵育过夜。 h. 第二天,用 2 mL StemFit 培养基更换培养基。如果有很多死细胞漂浮,继续向培养基中添加 Y-27632,最终浓度为 10 m M。 i.培养期间每 2 天更换一次培养基。j. iPSC 在第 6-8 天将达到半汇合状态。切勿让它们过度汇合。“半汇合”是指 iPSC 菌落直径小于 2 毫米,并且 iPSC 菌落之间仍有一些间隙。生长速度取决于 iPSC 系,因此应通过实验确定半汇合时间。
定期将视线从屏幕上移开几秒钟,让眼睛休息一下。别担心,这样你看起来会很认真,不会分心。转动手腕和脚踝,避开摄像头的视线。轻轻弯曲和放松背部和肩膀的肌肉。这个动作在镜头前看起来很微妙,但可以帮助缓解肌肉紧张。购买一张可调节高度的办公桌,这样你就可以从坐姿变为站姿。建议在长时间的会议中短暂休息,让参与者可以伸伸腿,去趟洗手间。
您必须在测试前几个小时快速(不吃)。您可能会有镇静剂注射以帮助您放松。躺在侧面时,局部麻醉剂将喷在喉咙的后部。您的喉咙麻木了,您的医生将轻轻通过嘴巴(内窥镜)穿过您的嘴并进入胃。内窥镜具有灯光和超声探针。超声探针使用声波来产生胃和附近器官的图片,以便您的医生可以看到任何异常的东西。也可以采集组织(活检)样品。
• 将上清液倒入含有 300 µl 异丙醇 >99% 的干净 1.5 ml 微管中 • 轻轻颠倒 50 次以混合样品 • 以 15,000 g 离心 1 分钟(DNA 应可见为小白色沉淀) • 弃去上清液并将管短暂排干在干净的吸水纸上。添加 500 µl 洗涤缓冲液并颠倒管数次以洗涤 DNA 沉淀 • 以 15,000 g 离心 1 分钟。小心弃去乙醇。 • 在室温下风干 10-15 分钟
按顺序排序的说明(请参见下列)(请参见下文)•通过拉动红色条带在管子上卸下收缩包裹•打开盖子并将设备从管子上卸下•将设备握在第二个手指和第3个手指和拇指之间(请勿按下!)•轻轻插入一个鼻孔,直到您的手指在学生的鼻子外面触摸•一直牢固地推入柱塞,直到不再显示绿线•扔掉•扔掉设备/管为止;一次使用•一旦学生警惕,给果汁或替代快速糖