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造血干细胞收集
1。Duong，H.K.，Savani，B.N.，Copelan，E.，Devine，S.，Costa，L.J.，Wingard，J.R.，Shaughnessy，P.，Majhail，N. et al2014。 外周血祖细胞动员，用于自体和同种异体造血细胞移植：美国血液和骨髓移植学会的指南。 生物血骨髓移植20：1262-1273。 2。 Weaver，C.H.，Schulman，K.A.，Wilson -Relyea，B.，Birch，R.，West，W.，Buckner，C.D。 2000。 在骨髓化学疗法后，用于收集周围血液干细胞的Filgrastim，Sargramostim或顺序的Sargramostim和Filgrastim的随机试验。 J Clin Oncol 18:43-53。 3。 isidori，A.，Tani，M.，Bonifazi，F.，Zinzani，P.，Curti，A.，Motta，M.R.，Rizzi，S.，Giudice，V.，Farese，O. II期研究单个PEGFIFGRASTIM注射是化学疗法的辅助，将干细胞动员到预处理的淋巴瘤患者的外周血中。 Haematologica 90：225-231。 4。 Simona，B.，Cristina，R.，Luca，N.，Sara，S.，Aleksandra，B.，Paola，B.，Federica，G.，Pierluigi，A.，Laura，O. 在恶性淋巴瘤患者高剂量化学疗法候选的恶性淋巴瘤患者中，单剂量的PEGFINGRASTIM与每日Filgrastim评估了自体外周造血祖细胞的动员和植入。 Thrfus Apher Sci 43：321-326。 5。 Russell，N.，Mesters，R.，Schubert，J.，Boogaerts，M.，Johnsen，H.E.，Canizo，C.D.，C.D.，Baker，N.，Barker，P.，Skacel，T.Duong，H.K.，Savani，B.N.，Copelan，E.，Devine，S.，Costa，L.J.，Wingard，J.R.，Shaughnessy，P.，Majhail，N.et al2014。外周血祖细胞动员，用于自体和同种异体造血细胞移植：美国血液和骨髓移植学会的指南。生物血骨髓移植20：1262-1273。2。Weaver，C.H.，Schulman，K.A.，Wilson -Relyea，B.，Birch，R.，West，W.，Buckner，C.D。 2000。 在骨髓化学疗法后，用于收集周围血液干细胞的Filgrastim，Sargramostim或顺序的Sargramostim和Filgrastim的随机试验。 J Clin Oncol 18:43-53。 3。 isidori，A.，Tani，M.，Bonifazi，F.，Zinzani，P.，Curti，A.，Motta，M.R.，Rizzi，S.，Giudice，V.，Farese，O. II期研究单个PEGFIFGRASTIM注射是化学疗法的辅助，将干细胞动员到预处理的淋巴瘤患者的外周血中。 Haematologica 90：225-231。 4。 Simona，B.，Cristina，R.，Luca，N.，Sara，S.，Aleksandra，B.，Paola，B.，Federica，G.，Pierluigi，A.，Laura，O. 在恶性淋巴瘤患者高剂量化学疗法候选的恶性淋巴瘤患者中，单剂量的PEGFINGRASTIM与每日Filgrastim评估了自体外周造血祖细胞的动员和植入。 Thrfus Apher Sci 43：321-326。 5。 Russell，N.，Mesters，R.，Schubert，J.，Boogaerts，M.，Johnsen，H.E.，Canizo，C.D.，C.D.，Baker，N.，Barker，P.，Skacel，T.Weaver，C.H.，Schulman，K.A.，Wilson -Relyea，B.，Birch，R.，West，W.，Buckner，C.D。2000。在骨髓化学疗法后，用于收集周围血液干细胞的Filgrastim，Sargramostim或顺序的Sargramostim和Filgrastim的随机试验。J Clin Oncol 18:43-53。3。isidori，A.，Tani，M.，Bonifazi，F.，Zinzani，P.，Curti，A.，Motta，M.R.，Rizzi，S.，Giudice，V.，Farese，O.II期研究单个PEGFIFGRASTIM注射是化学疗法的辅助，将干细胞动员到预处理的淋巴瘤患者的外周血中。Haematologica 90：225-231。4。Simona，B.，Cristina，R.，Luca，N.，Sara，S.，Aleksandra，B.，Paola，B.，Federica，G.，Pierluigi，A.，Laura，O.在恶性淋巴瘤患者高剂量化学疗法候选的恶性淋巴瘤患者中，单剂量的PEGFINGRASTIM与每日Filgrastim评估了自体外周造血祖细胞的动员和植入。Thrfus Apher Sci 43：321-326。5。Russell，N.，Mesters，R.，Schubert，J.，Boogaerts，M.，Johnsen，H.E.，Canizo，C.D.，C.D.，Baker，N.，Barker，P.，Skacel，T.Russell，N.，Mesters，R.，Schubert，J.，Boogaerts，M.，Johnsen，H.E.，Canizo，C.D.，C.D.，Baker，N.，Barker，P.，Skacel，T.PEGFIFGRASTIM和FIFGRASTIM的2阶段试验研究，用于动员非霍奇金淋巴瘤患者接受化学疗法的患者的外周血祖细胞。Haematologica 93：405-412。6。Hamadani，M.，Kochuparambil，S.T.，Osman，S.，Cumpston，A.，Leadmon，S.，Bunner，P.，Watkins，K.，Morrison，D.，Speir，E.中间 - 剂量与低剂量环磷酰胺和粒细胞菌落 - 刺激因子在多发性脊髓瘤患者中接受新型诱导疗法治疗的多发性骨髓瘤患者的刺激因子。生物血骨髓移植18：1128-1135。7。Wood，W.A.，Whitley，J.，Moore，D.，Sharf，A.，Irons，R.，Rao，K.，Serody，J.，Coghill，J.，Gabriel，D.，Shea，Shea，T.2011。用依托泊苷化学化对多发性骨髓瘤患者具有很高的有效，并克服了年龄和先前疗法的影响。生物血骨髓移植17：141-146。8。Mahindra，A.，Bolwell，B.J.，Rybicki，L.，Elder，P.，Kalaycio，M.，Dean，R.，Avalos，B.，Sobecks，R.依托泊苷加上G -CSF启动可以改善动员，而没有增加继发性骨髓增生和白血病的风险。骨髓移植47：231-235。9。Basquiera，A.L.，Abichain，P.，Damonte，J.C.，Ricchi，B.，Sturich，A.G.，Palazzo，E.D.，Garcia，J.J。 2006。 CD34 +）细胞的数量是外周血中的CD34细胞的预测因子，以预测（CD34 +）的产率，用于自体干细胞移植的患者。 J Clin Apher 21:92-95。 10。Basquiera，A.L.，Abichain，P.，Damonte，J.C.，Ricchi，B.，Sturich，A.G.，Palazzo，E.D.，Garcia，J.J。 2006。CD34 +）细胞的数量是外周血中的CD34细胞的预测因子，以预测（CD34 +）的产率，用于自体干细胞移植的患者。J Clin Apher 21:92-95。 10。J Clin Apher 21:92-95。10。Elliott，C.，Samson，D.M.，Armitage，S.，Lyttelton，M.P.，McGuigan，D.，Hargreaves，R.，Giles，C.，Abrahamson，G.，G.，Abboudi，Z. 动员疗法后何时收获周围血干细胞：通过前一天CD34-周围血液中的阳性浓度预测CD34-阳性细胞产量。 J Clin Oncol 14：970-973。 11。 M. 生物仿制药粒细胞菌落的官能性 - 刺激因子与发起者粒细胞菌落 - 刺激因子DE 中的外周血干细胞动员中的刺激因子Elliott，C.，Samson，D.M.，Armitage，S.，Lyttelton，M.P.，McGuigan，D.，Hargreaves，R.，Giles，C.，Abrahamson，G.，G.，Abboudi，Z.动员疗法后何时收获周围血干细胞：通过前一天CD34-周围血液中的阳性浓度预测CD34-阳性细胞产量。J Clin Oncol 14：970-973。11。M.生物仿制药粒细胞菌落的官能性 - 刺激因子与发起者粒细胞菌落 - 刺激因子DE
干细胞研究
转基因株系采用第二代 CRISPRa 系统，该系统携带与异源三聚体 VPR 反式激活因子融合的核酸酶缺陷型 dCas9，该异源三聚体 VPR 反式激活因子由 VP64、p65 和 RTA 结构域组成。该系统可用于解释任何所需细胞类型的内源性调控机制。使用基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑方法，我们以 AAVS1 人类基因组位点为目标，分别引入先前描述的 dCas9VPR-tdTomato（Schoger 等人，2020 年）和嘌呤霉素盒，这些盒受 CAG 和 EF1a 启动子的控制（图 1 A）。采用优化的核转染方案转染 LhiPSC-GR1.1 细胞。转染后，选择具有 tdTomato 表达的细胞并通过 PCR 进行基因分型（图 1B，引物结合如图 1A 所示，黑色引物仅扩增野生型 (WT) 片段；绿色引物扩增插入的构建体）。随后，扩增、分析和冷冻保存两个阳性克隆（#2 和 #3）。DNA 测序数据证实了 AAVS1 基因座中的正确和纯合敲入转基因整合（图 1C，显示为克隆#2）。PCR 结果显示，在筛选的 15 个克隆中，11 个克隆含有纯合插入（命名为 CRISPRa 细胞），1 个克隆是杂合的，3 个克隆不含有插入而是含有 WT 完整基因座（用作对照细胞）（数据未显示）。通过分析 PCR 和测序预测的前五个脱靶位点进行脱靶分析；在这些位点中均未发现任何编辑事件。对照电穿孔和非电穿孔 (参考) 系用于比较 (补充图 1A)。所有系的支原体检测均为阴性。通过基于 SNP 的核型分析和标准 G 带证明了 CRISPRa 克隆 #2 和 #3 以及对照细胞的基因组完整性。未检测到数值或结构异常的证据 (图 1D)。与核转染 (图 1Ei) 和非核转染对照相比，细胞生长和形态正常。与对照 hiPSC 相比，CRISPRa 中的 dCas9 和 tdTomato 表达证实了转基因表达，如 Western blot (补充图 1B，显示克隆 #2 和 #3) 和共聚焦显微镜 (图 1Eii，显示克隆 #2，n = 3 个不同传代) 所示。通过免疫荧光分析干性标记 OCT4 的表达（图 1 Eiii）和流式细胞术分析（显示 94.2% OCT4 和 99.9% TRA1-60 阳性细胞（图 1 Eiv）（显示克隆 #2））来评估多能性。通过在 CRISPRa 和对照系中形成胚状体 (EB) 和定向分化来测试向所有三个胚层的自发分化能力。免疫荧光分析证实了 AFP、β-III-Tu bulin 和 α-平滑肌肌动蛋白 (ACTA2) 的表达，进一步支持内胚层、外胚层和中胚层的命运（图 1 F，显示克隆 #2 和 #3）。转录水平分析表明配对盒 3 ( PAX3 ) 和微管相关蛋白 2 ( MAP2 ) 的表达表明外胚层分化；T-box 转录因子 T ( TBXT ) 表明中胚层命运，而 α-Feto-Protein ( AFP ) 表明内胚层分化（补充图 1 C，显示克隆 #2 和 #3）。我们研究了 CRISPRa 系用于研究通过定向 2D 分化产生的心肌细胞的适用性，这种分化产生了自发跳动的细胞（视频作为补充材料提供），具有强大的 α-辅肌动蛋白 2 (ACTN2) 和心脏肌钙蛋白 T (TNNT2) 心脏标志物表达（（补充图 1D，显示为克隆#2）。最后，我们通过确定与心脏肥大和代谢稳态有关的 KLF15 表达的诱导来测试 CRISPRa 系的功能。我们发现，与转染了非靶向 gRNA 的各自亲本系相比，设计用于结合 KLF15 转录起始位点 (TSS) 的 44 bp 5'-上游序列的单个指导 RNA 能够显着增强 CRISPRa 系（克隆#2 和#3）中 KLF15 的转录。对照细胞没有显示独立于转染的 gRNA 的活化（图 1G）。总之，使用完全表征的 hiPSC 系，我们生成了具有纯合靶向插入、正常核型和多能性的人类 CRISPRa 系，并显示出其激活
20240117 测试计划_TROPHIT1_V1.0_AIO
结直肠癌 (CRC) 是全球男性和女性中最常见的恶性肿瘤之一 1 。在美国，CRC 是第三大常见恶性肿瘤，也是男女癌症相关死亡的第三大原因 1 。对于这种转移性疾病，一线和二线的标准治疗方法是全身治疗，包括一、二或三种化疗药物和其他靶向药物 2 。一线治疗后，反应率急剧下降，且疾病控制时间很短。二线以上，瑞戈非尼、曲氟尿苷/替吡嘧啶 (TAS 102) 单独治疗或与贝伐单抗联合治疗是目前的标准治疗方法 3,4 。这些疗法的中位总生存期不到 11 个月。总而言之，临床实践中的许多患者除了 TAS102 之外没有其他治疗选择，而且治疗本身的疗效有限。对于诊断为转移性 CRC 的患者，存在明显而紧迫的医疗需求。迫切需要可耐受、有效和更具体的治疗方案。滋养层细胞表面抗原 2 (TROP2) 通过与几种下游分子结合或相互作用，在增殖、侵袭、迁移和凋亡等多种细胞过程中发挥作用 5 。TROP2 已被确定为癌症治疗策略的潜在靶标结构。TROP2 在肿瘤细胞表面富集，但在正常组织中存在较少。这导致了利用 TROP2 通过抗体-药物偶联物 (ADC) 将细胞毒化合物递送至癌细胞的策略。Sacituzumab Govitecan (SG，Trodelvy®) 由 TROP2 定向抗体与 SN38（一种抑制拓扑异构酶 1 的细胞抑制化合物）作为有效载荷连接而成。因此，SG 将 SN38 递送到 TROP2 阳性细胞中。根据 III 期数据显示与标准治疗相比具有优越性 6 ，SG 被批准用于治疗转移性、先前接受过治疗的三阴性乳腺癌 (TNBC)。重要的是，批准与肿瘤细胞中 TROP2 的表达无关，可用于治疗 TNBC。基于 TROPHY-U-01 的 II 期数据，SG 还在美国获批用于治疗尿路上皮癌 (UC)。针对不同肿瘤实体的几项适应症特定临床试验正在进行中。总而言之，TROP2 是治疗对先前全身治疗有抵抗力的 CRC 的有希望的候选靶点。在 IMMU-132-01 篮子试验中获得的 I/II 期数据显示，该药物在 mCRC 患者中具有可耐受的安全性 7 。然而，在接受过大量治疗的 CRC 患者中，疾病控制是可以改善的，因为只有 3.2% 的 CRC 患者经历了客观反应（定义为至少部分反应）。有趣的是，试验中 CRC 队列的 PFS 和总生存期 (OS) 最长，分别为 3.9 个月和 14.2 个月。这些观察结果表明，该药物具有隐藏的潜力，可以通过准确的患者选择来利用。考虑到作用机制并基于我们自己的研究，我们假设停用伊立替康的间隔期可能会显著提高 mCRC 对 SG 的反应性。在 TROPHIT1 研究中，我们旨在评估 SG 在 mCRC 二线治疗中的临床活性。TROPHIT 1 是一项随机、开放标签、多中心 II/III 期试验，比较 Sacituzumab Govitecan 与转移性难治性结直肠癌患者标准治疗的效果。该研究设计为两期试验：试验的第 I 部分将采用单组设计研究 Sacituzumab 对二十 (20) 名 mCRC 患者的疗效。如果第 I 部分显示出有意义的临床疗效（定义为总体反应 (ORR) 率≥ 10%），研究将继续进行第 II 部分。在试验的第 II 部分，TROPHIT1 旨在将 60 名患者以 1:1 的比例随机分配到 SG（实验组）或医生选择的治疗组（标准组）。主要入选标准包括转移性 CRC、之前接受过根据指南的两线治疗、体能状态良好以及至少六个月的伊立替康停药间隔。试验的主要终点是无进展生存期。