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每个矢量分子必须在一个位置上切割，以打开圆，以便可以插入新的DNA：切割不止一次的分子将被分解为两个或多个单独的片段，并且无用作为克隆载体。此外，每个矢量分子必须在圆上完全相同的位置切割。因此，需要一种非常特殊的核酸酶来进行此操作。
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