第1节:研究方法显微镜技术:光,相比,荧光,共聚焦,扫描和传播电子显微镜,细胞测量法和流式细胞仪,固定和染色,荧光内杂交(FISH),GISH(GISH(GISH),基因组中的基因组合杂交)。使用分子方法访问微生物多样性,例如剥落梯度凝胶电泳(DGGE),温度梯度凝胶电泳(TGGE),扩增的RRNA限制分析,终末限制性片段长度多态性(T-RFLP),16S rdna测序,Metagenomics to BiioInmics and Intermins(Ww Ww Ww Ww) HTML, URLs, Netscape, Explorer, Google, PUBMED), database management system, database browsing, data retrieval, sequence and genome database, databases such as GenBank, EMBL, DDBJ, Swissprot, PIR, TIGR, TAIR, Searching for sequence database like FASTA and BLAST algorithm, multiple sequence alignment, phylogenetic analysis and detection of open reading帧(ORF)。
在 NEBuffer 4 中,10 µl 反应物含有 40 ng 300 碱基单链 RNA 和至少 1 µl Luna® Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG,在 37°C 下孵育。孵育 4 小时后,通过荧光检测凝胶电泳测定,>90% 的底物 RNA 保持完整。
史蒂夫·刘易斯(Steve Lewis)00:00史蒂夫(Steve),欢迎谈到Mol Bio,这是一个有关分子生物学及其在生命科学中的趋势应用的播客系列。我是您的主人,史蒂夫·刘易斯(Steve Lewis),我想欢迎您进入我们所谓的Mol Bio分钟。这些是这个季节的迷你剧集,我们将在整集之间发行。常规的完整剧集将继续按常规的每月时间表发布。这些MOL生物分钟的长度较短,并且会在流媒体平台中使用我们的艺术品略有变化,以便您可以轻松地发现这些情节。他们将以我们在Thermo Fisher Scientific内部拥有的一些惊人才能,我们的扬声器将旋转以涵盖我们认为使用分子生物学方法在实验室中日常工作的人非常相关的各种主题。今天,您将听到Augustėužuotait的听到,谈到琼脂糖凝胶电泳中不同形式的DNA的迁移。我们希望您学到一些有用的东西。AugustėUžuotaitė01:13大家好。 我很高兴加入这个惊人的Mol Bio播客。 我的名字叫奥古斯(August),今天我们将潜入迷人的凝胶电泳世界,这是几乎每个生物学实验室中的主食。 但首先,您可能会问什么凝胶电泳是什么? 好吧,想象一个赛道,但是我们有DNA分子,而不是汽车或跑步者。 他们没有参加终点线,而是在凝胶上赛车。 就像在任何种族中一样,并非所有赛车手都是一样的。 现在,这里的凝胶不像头发中的凝胶。 然后AugustėUžuotaitė01:13大家好。我很高兴加入这个惊人的Mol Bio播客。我的名字叫奥古斯(August),今天我们将潜入迷人的凝胶电泳世界,这是几乎每个生物学实验室中的主食。但首先,您可能会问什么凝胶电泳是什么?好吧,想象一个赛道,但是我们有DNA分子,而不是汽车或跑步者。他们没有参加终点线,而是在凝胶上赛车。就像在任何种族中一样,并非所有赛车手都是一样的。现在,这里的凝胶不像头发中的凝胶。然后DNA分子具有不同的序列和构象,并且每个序列具有独特的速度。因此,这种速度或迁移率使我们能够将它们分开并分析它们。这是一个多孔矩阵,DNA分子在这些毛孔中操纵。它们越小,可以导航越快。,但它比大小要多。序列,对吗?ATS,可以影响其速度的DNA的GC。,然后是形状或构象。是线性的,是圆形的还是超级盘绕的?每个人都对迁移速度有自己的影响,并增加了该DNA种族的复杂性层。对于那些想要视觉的人,我会在这里为您服务。在马拉松比赛中,穿着不同尺寸的跑步者穿着不同的鞋子或选择不同的路径。那是您在电泳过程中凝胶中的DNA。因此,我们将从单链DNA和双链DNA的基础知识开始。然后,我们将其踢出一个缺口,讨论其他形式的DNA。,当然,我们将您指向资源,您可以在其中找到有关这些主题的更多信息。所以想象一下,您已经从某个供应商那里订购了一个500个基对双链DNA字符串,但这在货物中出乎意料的绕道而行。发生了很多事情,在发货期间经历了一些温度波动。现在您的PI或您的老板,希望您在开始实验之前检查DNA是否仍然完好无损; Wee不想浪费更多的试剂。这是您对凝胶电泳的理解。您需要选择正确的凝胶类型,缓冲液和电泳系统。将其视为设置DNA分子的赛道。您需要一个DNA梯子。这就像您的标尺一样,可以根据其大小来测量DNA分子。然后是决策。您应该加载多少样品?您应该设置什么电压?您应该让凝胶运行多长时间?这些就像设定比赛的距离和节奏。
设施:PCR 装置-自动热循环仪(Applied biosystems)凝胶文档系统(Biorad)、HPLC – 制备和分析(Shimadzu)、二氧化碳培养箱、蛋白质凝胶电泳系统(Amersham Pharmacia)、色谱柱(Amersham Pharmacia)、冷冻离心机(Heraeus)、分光光度计(Shimadzu 2)、14 升发酵罐 - 全自动(Scigenics)、迷你发酵罐(Eyela Inc. Japan)、伽马计数器(ECI)、相差显微镜(Nikon,日本)、倒置相差显微镜(Olympus CK 40)、冻干机(Yamata Neocool,日本)、电子天平(Mettler)、实时 PCR 应用生物系统)、纳米分光光度计、低温恒温器、-80˚C 深度冷冻机(Thermo、Panasonic、 Eppendorf)、脉冲场凝胶电泳 (PFGE)-Bio-Rad、II 级生物安全柜、步入式冷藏室、多模式平板读数器、荧光细胞分选器- FAC、带照相机附件和其他配件的倒置显微镜、荧光显微镜、植物组织培养设施、动物细胞培养设施、斑马鱼设施、秀丽隐杆线虫设施、小动物设施。
♦ 毛细管电泳 (CE) 是一种分离技术,利用施加的电压根据离子的电泳迁移率来分离离子。♦ 在毛细管凝胶电泳中,分子通过电流通过聚合物凝胶基质分离♦ 通过凝胶的运动基于分子的大小、形状和电荷♦ 十二烷基硫酸钠 (SDS) 使大多数蛋白质变性,并根据蛋白质的大小以相等的比例结合蛋白质,从而产生均匀的电荷质量比。
图3。凝胶电泳图像捕获超螺旋的,未消除的PUC19(泳道B);线性PUC19用Hindiii(泳道C)消化; PUC19用苯酚(150 ppm)升高,并消化了印度菌(D); PUC19用EDTA(20毫米)和Hindiii消化(Lane E)升高。在1.2%的琼脂糖凝胶上运行。梯子在车道A中显示为基座对。
图2。描述研究方法。根据长凳得分选择了两个CRISPR/CAS9指南,并注入斑马鱼。PCR和凝胶电泳评估了它们的DNA切割有效性。36小时后,去除死胚,观察到活的胚胎。在80小时时,对剩余的鱼进行了表型分析,并比较了微动物测定。每个指南五个胚胎进行了DNA测序以检测变化。
图1:纳米壳合成过程和稳定性验证的示意图。(a)通过三步固定过程在细胞膜上合成DNA纳米壳,包括:(i)A'-SSDNA启动器在糖科利克斯上的固定化; (ii)杆A(绿色)通过ssDNA杂交与A'-ssDNA结合,以及(iii)杆B(蓝色)通过H-SSDNA在杆A和H'ssDNA上的杂交在杆上的rod a和h'-ssDNA杂交的结合和交联。杆A和B的直径约为7nm,长度约为400nm。三个A-SSDNA(蓝色),14 s-ssDNA(黑色)和14 h-ssDNA(黄色)均匀分布在Rod A上。14 s-ssDNA(黑色)和14 h'-ssDNA(黄色)均匀分布在杆B上。所有ssDNA悬垂都是22对。比例尺:500 nm。(b)单个DNA棒的琼脂糖凝胶电泳,以及30分钟在37°C下孵育30分钟后杆的混合物。(c)单个DNA棒和两种类型的细胞培养基中的凝集的琼脂糖凝胶电泳研究。杆A和棒混合物。(d)通过铜免费点击化学,将DBCO标记的A'-SSDNA启动器固定在叠氮化物细胞表面糖脂上。
细菌学实验室分子生物学实验室已配备了用于标准PCR和实时PCR的热循环器。设备还包括Illumina ISEQ 100,值,线探针测定,GenExpert,琼脂糖凝胶电泳,跨粉碎机,冷却的离心机和生物安全罩。我们的敏捷贴纸提供了传统凝胶电泳的自动替代品,使研究人员能够分析仅来自少数几微升的DNA或RNA样品的数量和大小和大小。该中心的几个冰期设置为-20 O C,-80 O C,-150 O C,-150 O C,-150 O C,-150 O C,-150 O C,一个冷房间设置为4-8 0 C以用于样品存储。液氮可用于研究。我们新建的昆虫学实验室具有寄生虫文化的能力。我们新建的最新爆发准备块具有处理新疾病爆发所需的所有设施。诸如生物安全3级实验室(BSL-3),生物安全2级实验室,分子生物学,测序,生物信息学,电信,科学家的会议室和办公室等设施。安装的太阳系为BSL-3实验室的连续电力提供了保证。