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杆状病毒载体系统 CRISPR-Cas9 的进展：系统综述
摘要：杆状病毒表达载体系统 (BEVS) 已广泛用于在昆虫细胞中重组生产蛋白质，插入量高。然而，杆状病毒不能在哺乳动物细胞中复制；因此，开发了一种可以感染某些哺乳动物细胞的异源表达系统 BacMam 系统。从那时起，BacMam 系统已实现通过哺乳动物特异性启动子在人类细胞中实现转基因表达，后来，MultiBacMam 系统实现了在哺乳动物细胞中表达多种蛋白质。在本综述中，我们将介绍 BEVS 与 CRPISPR-Cas 技术相结合的持续发展，以推动哺乳动物细胞中的基因组编辑。此外，我们重点介绍了 CRISPR-Cas 在糖工程中的应用，以潜在地在昆虫细胞中生产一类新的糖蛋白药物。此外，我们预计 CRISPR-Cas9 将在蛋白质表达系统、基因治疗和未来推进基因组工程应用的发展中发挥关键作用。
利用设计 PPR 蛋白构建多功能、可编程的 RNA 结合蛋白及其在哺乳动物细胞剪接控制中的应用
摘要：RNA 在基因表达中发挥着许多重要作用，并参与各种人类疾病。尽管基因组编辑技术已经建立，但与基于核苷酸的 RNA 操作技术（如 siRNA 和 RNA 靶向 CRISPR/Cas）相比，操纵特定细胞 RNA 分子的序列特异性 RNA 结合蛋白的工程化尚不成熟。在这里，我们展示了一种使用含五肽重复 (PPR) 基序的蛋白质的多功能 RNA 操作技术。首先，我们开发了一种基于 PPR 的设计序列特异性 RNA 结合蛋白的快速构建和评估方法。该系统已经能够稳定构建数十种针对长 18 nt RNA 的功能性设计 PPR 蛋白，该蛋白针对哺乳动物转录组中的单个特定 RNA。此外，设计 PPR 蛋白的细胞功能首次通过控制报告基因或内源性 CHK1 mRNA 的可变剪接得到证明。我们的研究结果展示了一种使用 PPR 蛋白的多功能蛋白质 RNA 操作技术，该技术有助于理解未知的 RNA 功能和创建基因回路，并有可能用于未来的治疗。
通过介电油中的水滴进行电滴来将基因递送到哺乳动物细胞中的机理研究div>
，我们基于通过介电油中的水滴进行了短路，开发了一种新的方法，用于传递可渗透细胞的分子。将细胞悬架液滴放在具有强烈直流电场的一对电极之间，液滴弹跳和液滴变形，这会导致瞬时短路，这取决于电场强度。我们已经证明了使用短路成功地转移了各种哺乳动物细胞。但是，分子机械主义仍有待阐明。在这项研究中，用Jurkat细胞进行流式细胞仪测定。用液滴弹跳或短路处理含有jurkat细胞的水滴和带有荧光蛋白的质粒。短路可导致24小时孵育后足够的细胞活力和荧光蛋白表达。在很重要的情况下，液滴弹跳并未导致成功转染基因转染。通过摄取可耐细胞荧光染料yo-pro-1和钙离子的涌入来研究瞬态膜孔的形成。结果，短路增加了Yo-Pro-1氟-1荧光强度和细胞内钙离子浓度，但液滴弹跳没有。我们还研究了内吞作用对转染的贡献。用内吞作用抑制剂对细胞的预处理以依赖性的方式降低了基因转染的效率。此外，使用pH敏感的染料偶联物表明在短路后内体中形成了酸性环境。内吞作用是细胞内递送外源性DNA的可能机制。
在哺乳动物细胞中的敲入和敲除CRISPR/CAS9编辑作者：Michael Hanna 1，Pietro de Camilli 1 1 Neurosc的部门
在哺乳动物细胞中的敲击和淘汰CRISPR/CAS9编辑作者：Michael Hanna 1，Pietro de Camilli 1 1 1 1神经科学和细胞生物学部门，霍华德·休斯医学研究所，霍华德·休斯医学研究所，在纽约州纽约市纽黑文，纽约州纽黑文的蜂窝神经科学，神经变性和维修，纽约州纽黑文，纽约市210年6月210日，纽约市，纽约州。雪佛兰·蔡斯（Chevy Chase），医学博士，20815摘要该方案是为了帮助使用与上述出版物DPI相关的CRISPR/CAS9产生基因组和基因组编辑的哺乳动物细胞系（手稿尚未提交）。所需的缓冲液排序缓冲液1X DPB 0.02％EDTA 0.2％FBS敲除哺乳动物细胞系
使用 CRISPR 技术进行基因编辑
哺乳动物 CRISPR-Cas9 基因编辑系统利用 Cas9 使用 CRISPR 序列作为向导来识别和切割互补 DNA 链的能力。通过在哺乳动物细胞中表达 Cas9 核酸酶并引入针对目标基因的单个向导 RNA 序列 (sgRNA)，可以强制 Cas9 募集到目标 DNA 序列，从而将双链断裂引入基因组 DNA。在哺乳动物细胞中，这种双链断裂最常见的修复方法是非同源末端连接 (NHEJ)，这会导致切割位点删除或插入几个碱基对，通常导致移码和目标基因的功能失活。或者，同源重组 (HR) 系统可以参与修复，可以通过提供模板 DNA 来产生敲入突变或引入标签。
靶向原位蛋白质多样化和内部
工程蛋白必须在适当的生理环境下根据表型进行选择才能发挥作用。在这里，我们提出了一种通用方法，该方法允许在稳定条件下以每个细胞单一变体的方式在细胞质或亚细胞区室中生成表达多样化异源蛋白库的哺乳动物细胞组。为此，我们采用 CRISPR/Cas9 编辑技术来原位多样化目标蛋白的靶向片段。我们通过原位工程和溶酶体内特异性选择一种具有极强 pH 抗性的长斯托克斯位移红色荧光蛋白变体来证明该方法的实用性。根据哺乳动物细胞亚区室或细胞器的特定条件定制特性可以成为优化各种蛋白质、基于蛋白质的工具和生物传感器以实现不同功能的重要手段。
