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用不锈钢冠恢复原代磨牙后的牙周韧带的数值有限元分析Lina Zhang 1，Jiwen Geng 1
抽象背景：在全身麻醉下用不锈钢冠（SSC）恢复原代磨牙后，咬合高度调节的不确定性。方法：这项研究的目的是利用三维有限元分析（3D-FEA）来评估摄入咬合高度对牙周韧带（PDL）的影响。锥形束计算机断层扫描（CBCT）图像。构建了三维（3D）模型，随后分组如下：A组，SSC（对照组）未恢复的落叶磨牙。B1组，使用SSC恢复到正常闭塞的落叶磨牙。B2组，使用SSC恢复到正常闭塞的第一个落叶磨牙。B3，第二个落叶磨牙使用SSC恢复到正常的闭塞。 C1组利用SSC将第一和第二个落叶磨牙恢复到1 mm的咬合增加。 C2组应用SSC将第一个落叶磨牙恢复至1 mm的咬合增加。 C3组利用SSC将第二个落叶磨牙恢复到1 mm的咬合增加。 D1组采用SSC将落叶磨牙恢复到2 mm的咬合增加。 D2组（第一个落叶磨牙）用SSC恢复至2 mm的咬合增加。 组D3，第二摩尔还用SSC恢复，以实现2 mm的咬合增加。 使用3D-FEA分别以0、45和90度的角度分别施加到0、45和90度的角度，以评估对PDL的生物力学效应。B3，第二个落叶磨牙使用SSC恢复到正常的闭塞。C1组利用SSC将第一和第二个落叶磨牙恢复到1 mm的咬合增加。C2组应用SSC将第一个落叶磨牙恢复至1 mm的咬合增加。C3组利用SSC将第二个落叶磨牙恢复到1 mm的咬合增加。D1组采用SSC将落叶磨牙恢复到2 mm的咬合增加。D2组（第一个落叶磨牙）用SSC恢复至2 mm的咬合增加。组D3，第二摩尔还用SSC恢复，以实现2 mm的咬合增加。使用3D-FEA分别以0、45和90度的角度分别施加到0、45和90度的角度，以评估对PDL的生物力学效应。结果：在B1组和A组之间观察到PDL内最大von-Mises应力的统计学显着差异（P <0.01）。在SSC恢复后的咬合高度与PDL中的最大VON-MISS应力之间观察到正相关（P <0.01）。PDL中的最大von- mises应力与SSC修复的咬合高度呈正相关，与负载角度和年龄的负相关（P <0.01）。结论：建议将用SSC恢复的摩尔齿的咬合高度保持在2 mm的范围内。
原代肠成纤维细胞的长距离组织引导类器官衍生的肠上皮细胞定向和持续迁移
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2025 年 1 月 20 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.05.28.446131 doi：bioRxiv 预印本
多功能细胞穿透肽，用于原代干细胞中的多模态 CRISPR 基因编辑
CRISPR 基因编辑提供了前所未有的基因组和转录组控制，可精确调节细胞功能和表型。然而，将必要的 CRISPR 成分递送至治疗相关的细胞类型且不产生细胞毒性或意外副作用仍然具有挑战性。病毒载体存在基因组整合和免疫原性的风险，而非病毒递送系统难以适应不同的 CRISPR 载体，而且许多系统具有高度的细胞毒性。精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸 (RALA) 细胞穿透肽是一种两亲性肽，它通过与带负电荷的分子的静电相互作用自组装成纳米颗粒，然后将它们递送到细胞膜上。与其他非病毒方法相比，该系统已用于将 DNA、RNA 和小阴离子分子递送至原代细胞，且细胞毒性较低。鉴于 RALA 的低细胞毒性、多功能性和有竞争力的转染率，我们旨在将这种肽建立为一种新的 CRISPR 递送系统，适用于各种分子格式，适用于不同的编辑模式。我们报告称，RALA 能够有效地封装 DNA、RNA 和核糖核酸蛋白 (RNP) 格式的 CRISPR 并将其递送至原代间充质干细胞 (MSC)。RALA 与市售试剂之间的比较表明，其细胞活力更佳，可导致更多的转染细胞并维持细胞增殖能力。然后，我们使用 RALA 肽将报告基因敲入和敲除到 MSC 基因组中，以及转录激活治疗相关基因。总之，我们将 RALA 确立为一种强大的工具，可以更安全有效地以多种货物格式递送 CRISPR 机制，用于广泛的基因编辑策略。
用于人类原代免疫细胞和造血干细胞中 CRISPR 工程 (PERC) 的肽基核糖核蛋白递送
Srishti U Sahu 1,2,3,10、Madalena Castro 1,2,3,10、Joseph J Muldoon 4,5、Kunica Asija 1,2,3、Stacia K Wyman 1、Netravathi Krishnappa 1、Justin Eyquem 4,5,6,7,8,9、David N Nguyen 1,4,5、Ross C Wilson 1,2,3 隶属关系：1 美国加利福尼亚州伯克利市加州大学伯克利分校创新基因组学研究所。2 美国加利福尼亚州伯克利市加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系。3 美国加利福尼亚州伯克利市加州定量生物科学研究所。4 美国旧金山市格拉德斯通-UCSF 基因组免疫学研究所。5 美国旧金山市加州大学旧金山分校医学系。 6 美国加利福尼亚州旧金山市加利福尼亚大学帕克癌症免疫治疗研究所。7 美国加利福尼亚州旧金山市加利福尼亚大学微生物学和免疫学系。8 美国加利福尼亚州旧金山市加利福尼亚大学海伦·迪勒家庭综合癌症中心。9 美国加利福尼亚州旧金山市加利福尼亚大学人类遗传学研究所。10 这些作者对本研究的贡献相同。
基于microRNA的基因电路的模型引导设计支持转基因货物的精确剂量到多种原代细胞中
要实现在治疗应用中工程细胞的潜力，必须在治疗功效窗口内表达转基因。拷贝数和其他外在噪声来源的差异会在转基因表达中产生方差，并限制合成基因回路的性能。在治疗背景下，转基因的超生理表达可以损害工程表型并导致毒性。为了确保狭窄的转基因表达范围，我们设计和表征了co mpact m icrornam-iparna-iSage（命令）（命令），一个单移，基于microRNA的不相互分的前馈回路。我们通过实验调整命令输出配置文件，并为系统建模以探索其他调整策略。通过将命令与两基因实现进行比较，我们强调了单转录体系结构提供的精确控制，尤其是在相对较低的副本编号下。我们表明，指令严格调节慢病毒的转基因表达，并精确控制原代人T细胞，原代大鼠神经元，原代小鼠胚胎成纤维细胞和人类诱导的多能干细胞的表达。最后，命令有效地设置了狭窄窗口中临床相关的转基因FMRP1和FXN的水平。一起，命令是一种紧凑的工具，非常适合精确指定治疗货物的表达。
基于microRNA的基因电路的模型引导设计支持转基因货物的精确剂量到多种原代细胞中
要实现在治疗应用中工程细胞的潜力，必须在治疗功效窗口内表达转基因。拷贝数和其他外在噪声来源的差异会在转基因表达中产生方差，并限制合成基因回路的性能。在治疗背景下，转基因的超生理表达可以损害工程表型并导致毒性。为了确保狭窄的转基因表达范围，我们设计和表征了co mpact m icrornam-iparna-iSage（命令）（命令），一个单移，基于microRNA的不相互分的前馈回路。我们调整命令输出配置文件，并为系统建模以探索其他调整策略。通过将命令与两基因实现进行比较，我们强调了单转录体系结构提供的精确控制，尤其是在相对较低的副本编号下。我们表明，指令严格调节慢病毒的转基因表达，并精确控制原代人T细胞，原代大鼠神经元，原代小鼠胚胎成纤维细胞和人类诱导的多能干细胞的表达。最后，命令有效地设置了狭窄窗口中临床相关的转基因FMRP1和FXN的水平。一起，命令是一种紧凑的工具，非常适合精确指定治疗货物的表达。
利用 DNA-PKcs 抑制技术在人类原代细胞中通过同源性定向修复实现高效转基因整合
基于核酸酶的基因组编辑的治疗应用将受益于通过同源定向修复 (HDR) 进行转基因整合的改进方法。为了提高 HDR 效率，我们筛选了六种 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基 (DNA-PKcs) 的小分子抑制剂，DNA-PKcs 是替代修复途径非同源末端连接 (NHEJ) 中的关键蛋白，可产生基因组插入/缺失 (INDEL)。从这次筛选中，我们确定 AZD7648 是最有效的化合物。使用 AZD7648 可显著增加 HDR（高达 50 倍）并同时降低各种治疗相关的原代人类细胞类型中不同基因组位点的 INDEL。在所有情况下，HDR 与 INDEL 的比率均显著增加，并且在某些情况下，实现了无 INDEL 的高频 (>50%) 靶向整合。这种方法有可能提高基于细胞的疗法的治疗效果并扩大靶向整合作为研究工具的使用范围。
交联的肌动蛋白网络（氏族）会影响转基因转化和原代人小梁网络中的刚度和/或活性动力学
小梁网（TM）细胞中的交联肌动蛋白网络（氏族）可能通过改变TM细胞功能和刚度来增加IOP。但是，缺乏直接证据。在这里，我们开发了转化的TM细胞，形成自发荧光标记的氏族。通过将转化的青光眼TM（GTM3）细胞与柔抗脱反应-EGFP-BLASTR慢病毒载体载体并用BlastCidin选择，构建了稳定的细胞。使用原子力显微镜研究了GTM3-氟法中GFP细胞的刚度。还测量了用/不含地塞米松/TGFβ2处理的原代人TM细胞中氏族的弹性模量，以验证在GTM3-氟法中GFP细胞中的发现。对用1μM拉氏蛋白B或Phrodo Bioparticle处理的GTM3-氟法中的活细胞成像分别确定肌动蛋白稳定性和吞噬作用。GTM3-脱反性GFP细胞形成自发氏族，而无需诱导TGFβ2或地塞米松。与没有氏族的细胞相比，含有细胞的氏族显示出升高的细胞刚度，对latrunculin b诱导的肌动蛋白去聚合的抗性以及造成的吞噬作用。用来塞米松或TGFβ2诱导的氏族的原代人TM细胞也被僵硬，吞噬细胞较少。GTM3- LIFEACT-GFP细胞是研究TM中氏族的机械生物学和病理学的新工具。这些细胞的初始表征表明，氏族至少有助于TM细胞的一些青光眼表型。
基于 RNP 的原代 CD4+T 细胞编辑...
电穿孔后 72 小时，可使用 BioLegend APC 抗人 TCR α / β 抗体通过流式细胞术评估用靶向 Edit-R sgRNA RNP 的 TRAC 或 TRBC 编辑的原代 CD4 + T 细胞的 TCR α / β 敲除情况。除了通过流式细胞术读取表型外，在基于 RNP 的编辑后 48-72 小时内，可以通过 T7EI/TIDE 测量插入/缺失形成。使用表 1 中列出的每个经过验证的 sgRNA 的引物，遵循 Dharmacon™ Edit-R™ 合成 gRNA 阳性对照试剂盒方案中的直接细胞裂解和 PCR 条件。要测量 T7EI 内切酶的插入/缺失形成，请完成上面列出的方案并使用分析软件。要通过分解 (TIDE) 分析跟踪插入/缺失来测量插入/缺失形成，请将得到的 PCR 扩增子发送至 Sanger 测序并使用网络工具，例如 http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ 。以下方案描述了用于通过流式细胞术评估原代 CD4 + T 细胞中 TCR α / β 表型敲除的染色条件。1. 通过离心（300-5 分钟）沉淀用 PPIB、NTC2、TRAC 或 TRBC 靶向 RNP 电穿孔的 CD4 + T 细胞
利用 CRISPR-Cas9 对人类原代背根神经节神经元进行基因编辑并进行功能确认
1 德克萨斯大学西南医学中心麻醉学和疼痛管理系；6202 Harry Hines Blvd.，9 楼，德克萨斯州达拉斯 75235。2 德克萨斯大学达拉斯分校神经科学系和高级疼痛研究中心，800 W Campbell Rd，Richardson，TX 75080，美国。3 西南移植联盟。8190 Manderville Ln，德克萨斯州达拉斯 75231，美国。4 圣路易斯大学药理学和生理学系，1402 S. Grand Blvd.，密苏里州圣路易斯 63104，美国。5 亚利桑那大学药理学系，1501 N Campbell Ave，亚利桑那州图森 85721，美国。 6 佛罗里达大学药理学和治疗学系，1200 Newell Drive，ARB R5-234 Gainesville，FL 32610-0267。 * 通讯作者：Amol Patwardhan 和 Theodore Price † 这些作者对本文的贡献相同