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在人类原代 B 细胞中高效进行 CRISPR-Cas9 介导的诱变以识别浆细胞调节剂
人类 B 淋巴细胞是自身抗体介导疾病免疫疗法的有吸引力的靶点。基因编辑技术可以提供强大的工具来确定调节 B 细胞分化为浆细胞的基因调控网络，并确定预防和治疗自身免疫性疾病的新治疗靶点。在这里，我们描述了一种新方法，该方法使用 CRISPR-Cas9 技术在体外靶向人类原代 B 细胞中的基因以识别浆细胞调节剂。我们发现 sgRNA 和 Cas9 成分可以通过 RD114 假型逆转录病毒载体有效地递送到人类原代 B 细胞中。使用该系统，我们实现了大约 80% 的基因敲除效率。我们破坏了三种转录因子 IRF4、PRDM1 和 XBP1 的表达，并表明人类 B 细胞存活和浆细胞分化受到严重损害。具体而言，IRF4、PRDM1 和 XBP1 在浆细胞分化的不同阶段表达，IRF4、PRDM1 和 XBP1 靶向的 B 细胞分别无法进展到前浆母细胞、浆细胞状态和浆细胞存活。我们的方法为研究原代人类 B 细胞中的基因功能和确定用于治疗应用的新型浆细胞调节剂开辟了一条新途径。
原代纤毛在髓母细胞瘤中的亚组特异性作用
髓母细胞瘤是儿童中最常见的恶性肿瘤脑肿瘤，是导致肿瘤形成的失调发育机制的范式（Marino 2005）。它分为四个亚组（SHH，Wnt，G3和G4），每个子组进一步细分为亚型。已经确定了这些祖细胞的基本信号传导路径的放松调节，这些祖细胞的基本信号通路是综述的（有关审查，请参阅Marino和Gilbertson 2021）。在大脑中，原发性纤毛 - 基于微管的细胞结构，固定在基底体上，该结构用作纤毛微管组装的温度（Larsen等人2013） - 对其发展至关重要。它们从细胞的表面伸出，感知多个信号，并引入基本信号通路，包括关键的发育途径Sonic Hedgehog（SHH）和Wnt。例如，纤毛在SHH驱动的前脑图案中起着关键作用，包括中间神经元的迁移；在小脑发育中，特别是小脑祖细胞的扩张；在海马神经发生中2019）。Wnt介导的树突状细化和海马中成年牙齿颗粒细胞中的突触形成也是由Cilia进行的（Kumamoto et al。2012）。原发性纤毛在包括髓母细胞瘤在内的各种脑肿瘤的发病机理中被认为（Han等人2009），脉络丛 - 美国肿瘤（Li等人2016）和胶质母细胞瘤（Goranci-Buz-Hala等人2021）;但是，其角色的机械基础刚刚开始揭露。
基于电穿孔的 CRISPR/Cas9 基因工程使幼稚原代小鼠 CD8+ T 细胞保留体内免疫反应性
CRISPR/Cas9 技术彻底改变了原代细胞的基因工程。尽管它在 CD8 + T 细胞生物学研究中的应用势头迅猛，但 CRISPR/Cas9 对 CD8 + T 细胞体内功能的影响程度仍不清楚。在这里，我们优化了基于核转染的 CRISPR/Cas9 基因工程，用于幼稚和体外激活的小鼠原代 CD8 + T 细胞，并测试了它们的体内免疫反应。幼稚 CD8 + T 细胞的核转染保留了它们体内抗病毒免疫反应，其程度与未核转染的细胞没有区别，而体外激活的 CD8 + T 细胞的核转染导致在过继转移后的早期时间点扩增/存活率略有受损，收缩更为明显。值得注意的是，不同的靶蛋白在基因编辑后显示出不同的衰减率。这与完成基因失活所需的相当一段时间形成了鲜明对比。因此，为了实现最佳实验设计，确定靶基因产物丢失的动力学以适应基因编辑后的潜伏期至关重要。总之，基于核转染的 CRISPR/Cas9 基因组编辑可高效、快速地生成突变 CD8 + T 细胞，而不会对其体内功能造成不利限制。
mRNA 介导的基因编辑工具向人类原代肌肉干细胞递送
肌营养不良症是约 50 种毁灭性的、无法治愈的单基因疾病，会导致进行性肌肉退化和萎缩。使用基于 CRISPR/Cas9 的工具对可移植细胞进行基因校正是自体细胞替代疗法恢复许多遗传疾病器官功能的现实方案。然而，肌肉干细胞迄今为止一直落后，因为缺乏分离和繁殖它们的方法，而且它们易受大量离体操作的影响。在这里，我们展示了基于 mRNA 的 SpCas9 和腺嘌呤碱基编辑器的递送，可在来自许多捐赠者的人类肌肉干细胞中实现高达 90% 以上的基因组编辑效率，无论年龄和性别如何，并且无需任何富集步骤。使用 NCAM1 作为所有肌肉干细胞表达的内源性报告基因座，并且其敲除不会影响细胞适应性，我们表明用 mRNA 编辑的细胞完全保留了其成肌标记特征、增殖能力和功能属性。此外，基于 mRNA 的碱基编辑器递送可在单个无选择步骤中高效修复导致肌肉萎缩的 SGCA 突变。总之，我们的工作确立了基于 CRISPR/Cas9 的工具的 mRNA 介导递送是一种有前途且通用的方法，可将基因编辑的肌肉干细胞用于临床治疗肌肉疾病。
IQ亚型，大脑体积和免疫标记 毒理学 - UCL发现 - 伦敦大学学院 在正常范围内HBA1C之间的关联... 在支持1型糖尿病决策中以人为中心的机器学习的共同设计机会 预测电池的稳定锂铁硫化物... 远程随机电路中的运输和纠缠增长 定量评估临床前铸造的原代基因编辑人干细胞中染色体重排的定量评估 Neuroml-DB：共享和表征数据驱动的神经科学模型 数据注释人群神经影像学：全面的生成 关于安迪·派克（Andy Pike）地理政治经济学的评论 终生并通过细胞改善欧洲医疗保健 - 社论：衰老神经科学的深度学习 2型糖尿病在患者症状归因中的作用... 基于挑战性髓鞘的深度学习分割 布鲁顿的酪氨酸激酶抑制剂：一种新的治疗疗法... 胆固醇酯转移蛋白作为心血管疾病的药物靶标 大脑通信 - UCL发现 热还原石墨烯/MXENE膜，用于增强的li- ... 第2章能源安全的定义
1。UCL皇后广场神经病学研究所，英国伦敦UCL皇后广场研究所2.心理医学学院，心理学和神经科学研究所，英国伦敦国王学院，英国伦敦国王学院3.大脑映射单元，精神病学系，剑桥大学Herchel Smith大脑和心理科学大楼。精神病学部，英国伦敦帝国学院帝国学院； 5。 英国曼彻斯特大学神经科学与实验心理学系； 6。 MAHSC，英国曼彻斯特曼彻斯特大学； 7。 Lancashire和South Cumbria NHS基金会信托基金会，英国Accrington； 8。 剑桥郡和彼得伯勒NHS基金会信托基金会，英国剑桥； 9。 英国伯明翰大学心理健康研究所。 10。 爱丁堡大学临床脑科学中心精神病学系，精神病学部，英国伦敦帝国学院帝国学院； 5。英国曼彻斯特大学神经科学与实验心理学系； 6。 MAHSC，英国曼彻斯特曼彻斯特大学； 7。 Lancashire和South Cumbria NHS基金会信托基金会，英国Accrington； 8。 剑桥郡和彼得伯勒NHS基金会信托基金会，英国剑桥； 9。 英国伯明翰大学心理健康研究所。 10。 爱丁堡大学临床脑科学中心精神病学系，英国曼彻斯特大学神经科学与实验心理学系； 6。MAHSC，英国曼彻斯特曼彻斯特大学； 7。 Lancashire和South Cumbria NHS基金会信托基金会，英国Accrington； 8。 剑桥郡和彼得伯勒NHS基金会信托基金会，英国剑桥； 9。 英国伯明翰大学心理健康研究所。 10。 爱丁堡大学临床脑科学中心精神病学系，MAHSC，英国曼彻斯特曼彻斯特大学； 7。Lancashire和South Cumbria NHS基金会信托基金会，英国Accrington； 8。 剑桥郡和彼得伯勒NHS基金会信托基金会，英国剑桥； 9。 英国伯明翰大学心理健康研究所。 10。 爱丁堡大学临床脑科学中心精神病学系，Lancashire和South Cumbria NHS基金会信托基金会，英国Accrington； 8。剑桥郡和彼得伯勒NHS基金会信托基金会，英国剑桥； 9。英国伯明翰大学心理健康研究所。10。爱丁堡大学临床脑科学中心精神病学系，
基于 CRISPR 的原代 T 细胞基因编辑面临的挑战
摘要：自适应 T 细胞免疫疗法有望成功治疗白血病以及其他类型的癌症。最近，它还被证明是治疗免疫抑制患者慢性病毒感染的有效选择。用于免疫治疗的自体或同种异体 T 细胞通常经过基因改造以表达新的 T 细胞或嵌合抗原受体。使用 CRISPR/Cas 系统可以大大简化此类细胞的产生，从而可以在基因组内的特定位置删除或插入新基因。在这篇综述中，我们描述了最近对这些基因改造至关重要的方法学突破，总结了进行此类实验时需要考虑的关键点，并强调了这些方法的潜在缺陷。
高亲和力 CD16 整合到 CRISPR/Cas9 编辑的 CD38 基因座中可增强原代人类自然杀伤细胞的 CD38 定向抗肿瘤活性
摘要 背景 过继转移具有增强的抗体依赖性细胞毒作用 (ADCC) 能力和对 CD38 靶向性抗性的自然杀伤 (NK) 细胞有可能增强达雷木单抗 (DARA) 的临床抗骨髓瘤活性。因此，我们试图开发一种有效的基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑平台，以破坏离体扩增的 NK 细胞中的 CD38 表达 (CD38 敲除 (KO))，并同时为 CD38 KO NK 细胞配备高亲和力 CD16 (CD16-158V) 受体。方法 使用 Cas9 核糖核蛋白复合物生成 CD38 KO 人 NK 细胞。通过结合信使 RNA (mRNA) 转染 CD38 KO NK 细胞和在 CD38 位点插入靶向基因以介导基因敲入 (KI)，扩展了该平台。在体外和 MM.1S 异种移植小鼠模型中测试了这些基因编辑的 NK 细胞在 DARA 存在下持续存在和介导 ADCC 的能力。结果在体外扩增的 NK 细胞中实现了高效的 CD38 基因破坏，而不会影响其增殖或功能能力。CD38 KO 赋予了对 DARA 诱导的 NK 细胞自相残杀的抗性，在体外和 MM.1S 异种移植小鼠模型中，在 DARA 存在下，能够持续存在并增强对骨髓瘤细胞系的 ADCC。CD38 KO NK 细胞可以通过转染编码 CD16-158V 受体的 mRNA 进一步修饰，从而增强 DARA 介导的 ADCC。最后，我们观察到针对 CD38 基因座的同源定向修复模板促进了有效的 2 合 1 CD38 KO 与截短 CD34 报告基因和 CD16-158V 受体的 KI 结合，CD38 KO /CD16 KI NK 细胞在体外和体内均表现出 DARA 介导的 ADCC 的进一步增强。结论使用体外扩增的 CD38 KO /CD16 KI NK 细胞进行过继免疫治疗有可能提高 DARA 的临床疗效。通过将互补的基因工程策略整合到 CD38 KO 制造平台中，我们生成了具有显著增强的 CD38 定向抗肿瘤活性的 NK 细胞，为在临床上探索这种免疫治疗策略奠定了坚实的基础。
一种新型的非病毒递送方法，可实现原代人T细胞的有效工程进行体内细胞治疗应用
背景目的：下一代免疫细胞治疗产品将需要使用可以维持高水平细胞功能的工程技术进行复杂的修饰。非病毒工程方法具有解决与病毒载体相关的局限性的潜力。但是，尽管电穿孔是最广泛使用的非病毒模式，但对其对细胞功能的影响的担忧导致了替代方法的探索。在这里，作者研究了索洛波尔非病毒递送系统对工程原代人T细胞用于细胞治疗应用的适用性。方法：使用索洛波尔系统来传递信使RNA（mRNA），并定期间隔短的短静脉重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CAS9）指南RNA核糖核蛋白（RNP）Cargos与T细胞，并效率均匀地测量。通过免疫基因表达填充评估细胞扰动，包括电穿孔比较器。 分别使用实时细胞阻抗测定法和Raji-luciferase小鼠肿瘤模型评估了使用Solupore系统产生的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的体内和体内细胞毒性。 结果：通过单独，同时和顺序地使用Solupore系统分别，同时和顺序地递送MRNA和CRISPR CAS9 RNP Cargos来证明有效的转染，同时始终保持高水平的细胞活力。 基因表达促进显示免疫基因表达的改变很小，这表明细胞在此转染过程中经历的扰动水平低。细胞扰动，包括电穿孔比较器。分别使用实时细胞阻抗测定法和Raji-luciferase小鼠肿瘤模型评估了使用Solupore系统产生的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的体内和体内细胞毒性。结果：通过单独，同时和顺序地使用Solupore系统分别，同时和顺序地递送MRNA和CRISPR CAS9 RNP Cargos来证明有效的转染，同时始终保持高水平的细胞活力。基因表达促进显示免疫基因表达的改变很小，这表明细胞在此转染过程中经历的扰动水平低。通过骗局，电穿孔导致T细胞中免疫基因表达的显着变化。CAR T细胞在体外和体内表现出针对靶心癌细胞的有效细胞毒性。结论：Solupore系统是一种非病毒的手段，可以简单，快速，有效地将碳传递给原代人免疫细胞，并保留高细胞活力和功能性。©2021国际细胞与基因治疗学会。由Elsevier Inc.出版这是CC BY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）下的开放访问文章
对人类原代自然杀伤细胞的基因操作......
淋巴结外自然杀伤 (NK)/T 细胞淋巴瘤，鼻型 (ENKTCL) 是一种高度侵袭性的淋巴瘤，其中肿瘤抑制基因 PRDM1 经常丢失或失活。我们采用了两种不同的 CRISPR/Cas9 方法来生成 PRDM1 -/- 原代 NK 细胞，以研究该基因在 NK 细胞稳态中的作用。与野生型相比，PRDM1 -/- NK 细胞的克隆效率显著提高、增殖率更高、凋亡更少。基因表达谱显示，在 PRDM1 -/- NK 细胞中，与增殖、细胞周期、MYC、MYB 和 TCR/NK 信号相关的通路显著富集，但与正常细胞功能（包括细胞毒功能）相关的通路被下调，这表明 PRDM1 的缺失使 NK 细胞转向增殖和存活，而不是发挥其正常功能。我们还能够进一步修改 PRDM1 缺失的克隆，以引入 ENKTCL 中常见的肿瘤抑制基因（如 TP53、DDX3X 和 PTPN6）的杂合缺失。我们建立了体外模型来阐明 PRDM1 介导其对 NK 细胞的稳态控制的主要途径。这种方法可以应用于研究淋巴瘤发病机制中的其他相关遗传病变和致癌协同作用。
