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World File Search System原代
建立并鉴定患者来源的原代细胞系作为胆囊癌临床前模型
胆囊癌（GBC）是最常见的原发性胆道癌（BTC），是致死率最高的恶性肿瘤之一，来源于胆囊或胆囊管。GBC占BTC的近三分之二，是第六大常见胃肠道癌症（1），具有生长迅速、致死率高的特点。在中国，GBC是第五大胃肠道癌症，高发年龄为50～75岁，女性发病率约为男性的2倍（2,3）。GBC起病隐匿，早期诊断困难，恶性程度高，易发生早期转移，因此GBC预后极差，大多数患者初次诊断时已属晚期，晚期GBC的5年生存率为5%～10%（4）。
尺寸减小的质粒中的 Cas9 切割序列可增强原代人类 T 细胞中 CAR 的非病毒基因组靶向性
荆瑞平，焦佩玲，陈建军，孟晓燕博士，吴晓，段永刚博士，尚凯，钱琳，孙杰教授 浙江大学医学院附属第一医院细胞生物学系和骨髓移植中心 杭州 310058，中国 电子邮件：sunj4@zju.edu.cn 荆瑞平，焦佩玲，陈建军，孟晓燕博士，吴晓，段永刚博士，尚凯，钱琳，孙杰教授 浙江大学血液学研究所 & 浙江省干细胞与免疫治疗工程实验室 杭州 310058，中国 荆瑞平，焦佩玲，陈建军，孟晓燕博士，吴晓，段永刚博士，尚凯，孙杰教授 浙江省系统与精准医学实验室 浙江大学医学中心 杭州 310058，中国 黄勇，高晓燕教授浙江省西湖大学生命科学学院杭州 310058 刘菁，尹文教授浙江大学生物医学工程与仪器科学学院生物医学工程教育部重点实验室杭州 310058
在人类原代 B 细胞中高效 CRISPR-Cas9 介导基因敲除，用于 Epstein-Barr 病毒感染的功能遗传学研究
基因编辑现在已成为所有原核和后生动物细胞的常规技术，但在不到十年前 CRISPR-Cas9 技术被引入哺乳动物细胞生物学领域时，它在免疫细胞中并未受到太多关注。这种多功能技术已成功应用于人类髓系细胞和 T 细胞等的基因修饰，但应用于人类原代 B 细胞的情况很少，且仅限于活化的 B 细胞。这一限制阻碍了对这种细胞类型的细胞活化、分化或细胞周期控制的结论性研究。我们报告了在原代静息人类 B 细胞中进行高效、简单和快速的基因组工程，使用 Cas9 核糖核蛋白复合物的核转染，然后在 CD40 配体饲养细胞上进行 EBV 感染或培养以驱动体外 B 细胞存活。我们提供了使用两个模型基因在静止人类 B 细胞中进行基因编辑的原理证明：CD46 和 CDKN2A。后者编码细胞周期调节因子 p16 INK4a
HLA I 类基因敲除可将同种异体原代 NK 细胞转化为适合“现成”免疫疗法的效应细胞
到目前为止，使用嵌合抗原受体 (CAR) 的细胞免疫疗法几乎只使用自体外周血来源的 T 细胞作为免疫效应细胞。然而，对于患有恶性肿瘤和造血功能紊乱且接受过大量预先治疗的患者，收集足够数量的 T 细胞通常具有挑战性。此外，这种 CAR 产品始终针对单个患者。相反，由于这些先天免疫细胞缺乏同种反应，因此可以在非 HLA 匹配环境中进行 NK 细胞输注。尽管如此，输注的 NK 细胞仍会被患者的免疫系统识别和排斥，从而限制了它们在体内的寿命并破坏了多次输注的可能性。在这里，我们设计了基因组编辑和先进的慢病毒转导方案，使原代人类 NK 细胞对受体 CD8 + T 细胞的同种异体反应不敏感/有抵抗力。通过 CRISPR/Cas9 靶向 B2M 基因敲除 HLA I 类分子的表面表达后，我们还共表达了单链 HLA-E 分子，从而通过“缺失自我”诱导的裂解防止 NK 细胞与 B2M 敲除 (KO) 细胞自相残杀。重要的是，这些基因工程 NK 细胞在表型和对不同 AML 细胞系的天然细胞毒性方面与未改造的 NK 细胞在功能上没有区别。在共培养试验中，B2M-KO NK 细胞既不会诱导同种异体 T 细胞的免疫反应，也不会重新激活使用相应 NK 细胞供体的辐照 PBMNC 扩增/引发的同种异体 T 细胞。我们的研究证明了在原代同种异体 NK 细胞中进行基因组编辑的可行性，可以减少不匹配的 T 细胞对其的识别和杀伤，并且是使用非 HLA 匹配的原代人类 NK 细胞作为现成的“现成的”免疫效应物用于人类癌症的各种免疫治疗适应症的重要先决条件。
NPC中CDC25C的下调干扰了皮质神经发生编辑的原代山羊细胞
遗传改性细胞的基因分型是针对转基因和基因组编辑的至关重要的步骤，例如CRISPR/CAS等系统。检测基因组编辑事件可以与所使用的基因分型方法直接相关，该方法受其成本影响，因为许多实验需要分析大量样品。这项研究的目的是比较基因组DNA（GDNA）提取的直接裂解方法的性能，以检测原代山羊细胞中的敲蛋白和敲除。最初，使用差异量（1,000、5,000和10,000个细胞）和goat Ortiparts（fibroblblasts and fibroblblasts and gote anctermarem Migalsmary Migalmary Migalmary Migalmary Migatiars Migatiars Migatiars）测试了三种GDNA提取方案（方案A，水中的温度A; Prote变性/冻结；小（GAPDH）和大扩增子（HLF转基因）的PCR扩增。所有方案在检测小扩增子方面均成功；但是，在GMEC中，只有协议B仅导致有效的扩增（协议A - 0％，协议B- 93％，协议C- 13.33％，p <0.05）。In a proof- of-principle experiment, the TP53 gene was knocked out in GMECs by CRISPR/Cas9-medi- ated deletion while constructs containing the anti-VEGF monoclonal antibody (pBC-anti- VEGF) and bacterial L-Asparaginase (pBC-ASNase) transgenes were knocked-in sepa- rately in fibroblasts.使用协议B和PCR进行了成功编辑的检测。根据PCR，PBC-ASNase和PBC-Anti-VEGF转基因的整合速率分别为93.6％和72％。使用CRISPR/CAS9对TP53缺失在GMEC中的双重编辑效率为5.4％。我们的结果表明，方案B（热变性/蛋白酶K）可以用作一种廉价且快速的方法，用于检测不同类型的原代山羊细胞中的遗传修饰，其效率率与先前使用提取试剂盒或更复杂的蛋白酶K配方中先前描述的值一致。
与分子分析相关的药物筛选确定了儿童高级别胶质瘤和 DIPG 患者原代培养物中的新依赖性
。CC-BY 4.0 国际许可证永久有效。它以预印本形式提供（未经同行评审认证），作者/资助者已授予 bioRxiv 许可，可以在该版本中显示预印本。版权所有者于 2020 年 12 月 30 日发布了此版本。；https://doi.org/10.1101/2020.12.29.424674 doi: bioRxiv preprint
一种在原代细胞培养中进行多等位基因 CRISPR-Cas9 编辑的简单高效方法
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者（此版本于 2020 年 7 月 1 日发布。；https://doi.org/10.1101/2020.07.01.183145 doi：bioRxiv 预印本
原代人间充质干细胞的扩展Invitro培养物下调BRCA1相关的基因并损害DNA双链断裂识别
间充质干细胞（MSC）是多素的成年干细胞，对基于细胞的再生疗法有很大潜力。体外扩展改变其表观遗传和细胞特性，对DNA损伤反应（DDR）和基因组稳定性的影响很差。我们在这里报告了基于转录组的基于转录组的途径分析的结果，该途径分析了体外 - 脱落的人骨骨髓衍生的间充质干细胞（HBM-MSC），并补充了针对DNA双链断裂（DSB）修复的细胞测定。使用基因，KEGG和GSEA映射受体外衰老影响的基因途径，并被发现涉及DNA修复，同源重组（HR），细胞周期控制和染色体复制。在HBM-MSC中对X射线诱导的X射线诱导的DNA DSB的识别（C-H2AX + 53BP1焦点）的测定表明，在8周的体外衰减期间（即10个双倍的时间），细胞表现出较高的DDRADNA ddra。此外，观察到对DNA DSB识别受损的细胞的明显亚群。通过HR（例如Rad51，Rad54，BRCA1）参与DNA修复中的几个基因显示2.3至四倍降低了QRT-PCR的mRNA表达。我们得出的结论是，HMSC的体外扩张会导致与DNA断裂的识别和修复的衰老相关损害。
原代人间充质干细胞的扩展Invitro培养物下调BRCA1相关的基因并损害DNA双链断裂识别
间充质干细胞（MSC）是多素的成年干细胞，对基于细胞的再生疗法有很大潜力。体外扩展改变其表观遗传和细胞特性，对DNA损伤反应（DDR）和基因组稳定性的影响很差。我们在这里报告了基于转录组的基于转录组的途径分析的结果，该途径分析了体外 - 脱落的人骨骨髓衍生的间充质干细胞（HBM-MSC），并补充了针对DNA双链断裂（DSB）修复的细胞测定。使用基因，KEGG和GSEA映射受体外衰老影响的基因途径，并被发现涉及DNA修复，同源重组（HR），细胞周期控制和染色体复制。在HBM-MSC中对X射线诱导的X射线诱导的DNA DSB的识别（C-H2AX + 53BP1焦点）的测定表明，在8周的体外衰减期间（即10个双倍的时间），细胞表现出较高的DDRADNA ddra。此外，观察到对DNA DSB识别受损的细胞的明显亚群。通过HR（例如Rad51，Rad54，BRCA1）参与DNA修复中的几个基因显示2.3至四倍降低了QRT-PCR的mRNA表达。我们得出的结论是，HMSC的体外扩张会导致与DNA断裂的识别和修复的衰老相关损害。
CRISPR-Cas9 核糖核蛋白介导的成熟原代先天免疫细胞中的基因组编辑
CRISPR 基因组工程已成为一种功能性研究免疫系统调节复杂机制的强大工具。尽管数十年来一直致力于对先天免疫进行遗传重编程，但当前方法的实用性受到体内成熟细胞谱系的敲除效率低或特异性有限的限制。在这里，我们描述了一种优化的非病毒 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白 (cRNP) 基因组编辑策略，该策略可对成熟的原代小鼠先天淋巴细胞 (ILC) 和髓系细胞进行基因组编辑，从而导致单次电穿孔导致单或双靶基因表达几乎完全丧失。此外，我们描述了体内过继转移小鼠模型，该模型可用于使用 cRNP 编辑的幼稚自然杀伤 (NK) 细胞和骨髓衍生的常规树突状细胞前体 (cDCP) 筛选病毒感染期间的基因功能。该资源将增强靶基因发现，并为小鼠先天免疫系统中的基因编辑提供一种特定且简化的方法。