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World File Search System报告基因
荧光体内编辑报告基因（FIVER）
摘要 基因组编辑技术的进步为治疗罕见遗传疾病创造了机会，而这些疾病在治疗开发方面往往被忽视。尽管如此，仍然存在重大挑战：即在正确的细胞类型中实现对治疗有益的编辑水平和种类。在这里，我们描述了 FIVER（荧光体内编辑报告基因）的开发——这是一种模块化工具包，用于体内检测基因组编辑，具有非同源末端连接（NHEJ）、同源定向修复（HDR）和同源独立的靶向整合（HITI）的不同荧光读数。我们证明荧光结果可靠地报告在原代细胞、类器官和体内使用不同基因组编辑器编辑后的遗传变化。我们展示了 FIVER 在高通量无偏筛选中的潜力，从原代细胞中基因组编辑结果的小分子调节剂到全基因组体内 CRISPR 癌症筛选。重要的是，我们展示了其在基因治疗感兴趣的出生后器官系统（视网膜和肝脏）中的体内应用。FIVER 将广泛地帮助加快许多遗传疾病的治疗性基因组手术的发展。
ADCC 报告基因生物测定，完整试剂盒 (Raji)
抗体依赖性细胞介导细胞毒性 (ADCC) 是抗体的一种作用机制，通过这种机制，病毒感染或其他患病细胞被细胞介导免疫系统的成分（例如自然杀伤细胞）靶向破坏。ADCC 报告生物测定 (a–e) 是一种生物发光报告测定，用于在 ADCC 作用机制 (MOA) 测定中量化治疗性抗体药物对通路激活的生物活性。该测定结合了简单的添加-混合-读取格式、以冷冻、解冻和使用格式提供的效应细胞以及优化的方案，以提供具有低变异性和高准确性的生物测定。此外，生物测定可以在一天内完成。这些性能特征使生物测定适用于抗体药物研究、开发和生产批次放行等应用。 ADCC 报告生物测定试剂盒中提供的解冻即用细胞是在高度受控的条件下生成的，这使得每次运行的测定变化性较低，同时提供了测定试剂的便利，无需每次繁殖和准备细胞。
使用双荧光分析法筛选巨噬细胞中的炎症诱导报告基因载体
北卡罗来纳州立大学，教堂山，27599，北卡罗来纳州，美国 8 9 *通讯地址 10 Christopher E. Nelson，博士 11 生物医学工程系 12 120 John A. White Jr. 工程大厅 13 阿肯色大学 14 费耶特维尔，阿肯色州 72701 15 479-575-2615 16 nelsonc@uark.edu 17 18 摘要 19 巨噬细胞是再生医学和癌症免疫疗法等各种应用治疗的有希望的目标。由于其可塑性，巨噬细胞可以在最小的环境变化下从非活化状态转变为活化状态。为了使巨噬细胞在各自的应用中有效，有必要筛选表型变化以阐明细胞对不同运载工具、疫苗、小分子和其他刺激的反应。我们基于 NF- κ B 的激活创建了一种灵敏且动态的高通量巨噬细胞筛选方法。对于该报告基因，我们将 mCherry 荧光基因置于炎症启动子的控制之下，该启动子会募集 NF- κ B 反应元件来促进巨噬细胞炎症反应期间的表达。我们根据巨噬细胞炎症反应的关键标志物（包括 TNF- α 细胞因子释放和炎症和非炎症细胞表面标志物的免疫染色）来表征炎症报告基因。利用炎症报告基因，我们还能够创建 LPS 剂量曲线来确定报告基因的动态范围，并通过对刺激与非刺激处理的报告细胞进行时间点分析来确定报告基因对刺激的敏感性。然后，我们使用报告细胞系来确定递送效率和对不同病毒和非病毒基因递送载体的炎症反应。这里开发的筛选技术 34 提供了一种动态、高通量筛选技术，用于确定 35 小鼠巨噬细胞对特定刺激的炎症反应，并深入了解小鼠 36 巨噬细胞对不同病毒和非病毒基因传递方法的炎症反应。 37 38 简介 39 巨噬细胞是吞噬细胞，负责防御外来入侵者并维持 40 所有器官和组织 1-3 的体内平衡。根据微环境，巨噬细胞会改变功能 41 以响应局部需要。巨噬细胞的可塑性导致形成异质性 42 巨噬细胞表型群以应对情况，无论是防御、维持还是在 43 激活状态之间转换。巨噬细胞作为肿瘤相关巨噬细胞 (TAMS) 在肿瘤和 44 体内再生过程发挥作用。对于许多癌症来说，巨噬细胞在肿瘤 45 微环境中丰富，TAMS 负责促进转移、免疫抑制和 46 促进侵袭和血管生成 4 。巨噬细胞还负责维持从最初的炎症到清除外来入侵者的愈合过程，募集必要的免疫细胞，以及在再生的最后阶段解决愈合过程 5–9 。 49 50 巨噬细胞由于其在活化 51 状态之间切换的能力，可以参与各种各样的活动。对巨噬细胞极化状态的理解在不断发展，在最基本的层面上 52 要么是经典的激活/炎症状态，要么是激活/抗炎状态。这些 53 状态也被描述为 M0（静息）、M1（炎症）和 M2（抗炎）。由于 54 它们的实用性，巨噬细胞已被用于许多不同的应用，从肿瘤学的细胞疗法到再生中局部环境的重新编程 10–16 。虽然巨噬细胞提供了 56
使用 CRISPR/Cas9 系统和双链 DNA 供体标记荧光报告基因蛋白
Sylvain Geny、Simon Pichard、Alice Brion、Jean-Baptiste Renaud、Sophie Jacquemin 等人。使用 CRISPR/Cas9 系统和双链 DNA 供体标记带有荧光报告基因的蛋白质。Arnaud Poterszman。多蛋白复合物，2247，Springer；Humana，第 39-57 页，2021 年，分子生物学方法，978-1-0716-1125-8。�10.1007/978-1-0716-1126-5_3�。�hal-03092017�
PEAR 是一种灵活的荧光报告基因，用于识别和富集已成功进行先导编辑的细胞
摘要 Prime editing 是一种最近开发的基于 CRISPR/Cas9 的基因工程工具，可用于在基因组中引入短插入、删除和替换。然而，Prime edit 的编辑率通常约为 10%–30%，效率却与其多功能性不符。本文，我们介绍了 Prime editor 活性报告基因 (PEAR)，这是一种灵敏的荧光工具，可用于识别具有 Prime edit 活性的单个细胞。PEAR 没有背景荧光，可特异性指示 Prime edit 事件。它的设计为整个间隔序列的序列变异提供了无限的灵活性，使其特别适合于系统地研究影响 Prime edit 活性的序列特征。使用 PEAR 作为 Prime edit 的富集标记可使编辑群体增加高达 84%，从而显著提高 Prime edit 在基础研究和生物技术应用中的适用性。
PEAR：一种灵活的荧光报告基因，用于识别和富集成功进行先导编辑的细胞
(a) Prime Editor 活性报告基因 (PEAR) 的示意图。PEAR 的机制基于与 BEAR 相同的概念，并且包含相同的非活性剪接位点，如图 (a) 所示。PE 可以将“G-AC - AAGT”序列恢复为规范的“G-GT-AAGT”剪接位点。与 BEAR 不同的是，这里的 Prime 编辑发生在 DNA 的反义链上，因此，这种方法使我们能够将间隔序列定位在内含子内。这里，整个间隔的长度是可以自由调整的（显示为“N”-s）。剪接位点的改变的碱基显示为红色，编辑的碱基显示为蓝色。PAM 序列为深绿色，nCas9 为蓝色，融合的逆转录酶为橙色。
开发用于高内涵筛选的 CRISPR/Cas9 介导荧光报告基因人类多能干细胞系
摘要：应用 CRISPR/Cas9 系统将荧光蛋白敲入人类多能干细胞 (hPSC) 中的内源性目的基因，有可能促进基于 hPSC 的疾病建模、药物筛选和移植疗法优化。为了评估荧光报告 hPSC 系用于高内涵筛选方法的能力，我们将 EGFP 靶向内源性 OCT4 基因座。产生的 hPSC–OCT4–EGFP 系表达与多能性标记物一致的 EGFP，并且可以适应多孔格式以进行高内涵筛选 (HCS) 活动。然而，在长期培养后，hPSC 暂时失去了 EGFP 表达。或者，通过将 EGFP 敲入 AAVS1 基因座，我们建立了稳定且一致的 EGFP 表达 hPSC–AAVS1–EGFP 系，该系在体外造血和神经分化期间保持 EGFP 表达。因此，hPSC–AAVS1–EGFP 衍生的感觉神经元可适应高内涵筛选平台，该平台可应用于高通量小分子筛选和药物发现活动。我们的观察结果与最近的发现一致，表明在 OCT4 基因座进行 CRISPR/Cas9 基因组编辑后会出现高频率的靶向复杂性。相反，我们证明 AAVS1 基因座是 hPSC 中的安全基因组位置，具有高基因表达，不会影响 hPSC 质量和分化。我们的研究结果表明，应应用 CRISPR/Cas9 整合的 AAVS1 系统来生成稳定的报告 hPSC 系以用于长期 HCS 方法，并且它们强调了仔细评估和选择应用的报告细胞系以用于 HCS 目的的重要性。
基因组报告构建体监测通路特异性...
DNA 双链断裂 (DSB) 的修复可能是无错误的，也可能是高度致突变的，这取决于修复断裂的多种机制不同的途径中的哪一种。因此，DSB 修复途径的选择直接影响基因组的完整性，因此了解引导修复走向特定途径的参数是有意义的。这已使用基因组报告构建体进行了深入研究，其中通过目标途径修复位点特异性 DSB 会产生可量化的表型，通常是荧光蛋白的表达。使用 Cas9 等可靶向核酸酶进行基因组编辑的最新发展增加了报告基因的使用，并加速了新型报告基因构建体的生成。考虑到这些最新进展，本综述将讨论和比较可用的 DSB 修复途径报告基因，提供指导报告基因选择的基本考虑因素，并展望未来的潜在发展。
针对乳腺癌发育中的芳基烃受体信号通路
ucd-pymt，产生显性阴性蛋白，该蛋白特异性抑制了由Charles Vinson（NCI，Bethesda，MD，MD，USA）提供的C/EBP成员的DNA结合。根据制造商的说明，使用JetPEI（Polytransfection; Qbiogene，Irvine，CA，美国）进行瞬态转染。允许转染进行16小时，并用1 nm TCDD或0.1％DMSO（对照）处理细胞24小时，然后再诱导凋亡或用TCDD处理TCDD进行RNA表达分析。用于DRE荧光素酶报告基因测定UCD-PYMT细胞用DRE报告基因质粒瞬时转染。 16小时后，用1 nm TCDD或0.1％DMSO（对照）处理4小时。将细胞裂解，并使用Luminometer（Berthold Lumat LB9501/16;宾夕法尼亚州匹兹堡）使用荧光素酶报告基因测定系统（Promega Corp.，Madison，WI）测量荧光素酶活性。 使用Bradford染料测定法（Bio-Rad Laboratories，Inc。，Hercules，CA）将相对光单元标准化为蛋白质浓度。用于DRE荧光素酶报告基因测定UCD-PYMT细胞用DRE报告基因质粒瞬时转染。16小时后，用1 nm TCDD或0.1％DMSO（对照）处理4小时。将细胞裂解，并使用Luminometer（Berthold Lumat LB9501/16;宾夕法尼亚州匹兹堡）使用荧光素酶报告基因测定系统（Promega Corp.，Madison，WI）测量荧光素酶活性。使用Bradford染料测定法（Bio-Rad Laboratories，Inc。，Hercules，CA）将相对光单元标准化为蛋白质浓度。
PDE4D 细胞活性检测试剂盒
目录 #60505 描述 磷酸二酯酶 (PDE) 在 cAMP 和 cGMP 信号的动态调节中起着重要作用。PDE4D 具有 3',5'-环-AMP 磷酸二酯酶活性并降解 cAMP。PDE4D 抑制剂抑制其活性会导致细胞内 cAMP 水平升高。PDE4D 基因编码至少 9 种不同的异构体，与中风、哮喘、心律失常和心肌病有关，使其成为重要的治疗靶点。PDE4D 细胞活性检测旨在筛选培养细胞中的 PDE4D7 抑制剂。该检测基于用 CRE 荧光素酶报告基因转染细胞。CRE 报告基因包含受 cAMP 反应元件 (CRE) 控制的萤火虫荧光素酶基因。细胞内 cAMP 升高会激活 CRE 结合蛋白 (CREB) 以结合 CRE 并诱导荧光素酶的表达。福斯高林常用于提高细胞生理学研究中的细胞内 cAMP 水平。当用 CRE 报告基因瞬时转染的细胞被福斯高林激活时，细胞内 cAMP 水平上调，从而诱导 CRE 荧光素酶报告基因的表达。然而，当细胞用 PDE4D7 表达载体和 CRE 报告基因共转染时，福斯高林诱导的 cAMP 水平降低，导致荧光素酶表达水平降低。当用 PDE4D 抑制剂处理细胞以抑制 PDE4D7 活性时，cAMP 水平恢复，导致荧光素酶活性更高。该试剂盒包括 CRE 荧光素酶报告基因（预混有组成性表达的 Renilla（海三色堇）荧光素酶载体，作为转染效率的内部对照）、PDE4D7 表达载体和福斯高林。应用