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World File Search System报告基因
果蝇睾丸中Mitf/TFEB的减数分裂活性随年龄增长而下降
诱导 GFP 表达。C、D. 成年年轻果蝇睾丸中的 DNA（Hoechst）和 4Mbox-GFP（Mitf 活性报告基因）的代表性图像。D 中勾勒出了 C 中精原细胞和精母细胞的放大区域。C 中勾勒出了囊细胞核。DE 中的虚线标出了有丝分裂到减数分裂的转变。对成年年轻雄性有丝分裂精原细胞（n = 10 个睾丸中的 50 个精原细胞）和减数分裂精母细胞（n = 10 个睾丸中的 50 个精母细胞）中 4MBox-GFP 强度的量化。平均值 ± SD p < 0.0001，Mann-Whitney U 检验。 F. 量化年轻男性（n =60 个精母细胞，来自 12 个睾丸）和老年男性（n =80 个精母细胞，来自 16 个睾丸）精母细胞中 4Mbox-GFP 强度。平均值 ± SD p < 0.0001，Welch t 检验。G. 年轻和老年男性精母细胞中 DNA（Hoechst）和 4Mbox-GFP（Mitf 活性报告基因）的代表性图像。H. 量化年轻男性（n =60 个精母细胞，来自 12 个睾丸）和老年男性（n =65 个精母细胞，来自 13 个睾丸）精母细胞中 VhaSFD-GFP 强度。平均值 ± SD p < 0.0001，Welch t 检验。I. 年轻和老年男性精母细胞中 DNA（Hoechst）和 VhaSFD-GFP 的代表性图像。条，20 µm。
通过双向启动子通过四环素共同调节两个基因活性通过双向启动子通过四环素共同调节两个基因活性
最近，我们描述了一个调节系统，该系统允许在较高的真核细胞系（1），植物（2）和动物（3,4）中严格控制单个基因活性。该系统的基本组件是（i）一个RNA聚合酶H最小启动子，放置在多个操作序列（TETO）的下游，其大肠杆菌tnjo Tetracycline抗性操纵子和（ii）TET抑制剂（TET）（TETR）和Simples Simples Simplex Virus Protein 16（vpp16（vp p p p）（ii）（ii）（ii）融合。在不存在四环素（TC）的情况下，TTA与TET算子结合以激活最小启动子的转录，而在TC存在下，它的关联并因此阻止了其转录激活。在TTA结合后，源自巨细胞病毒IE启动子（PHCMV，5）的最小启动子，并融合到七个TETO序列中，当在短暂性表达测定中进行比较时，在HELA细胞中的父启动子的明显强度达到了显着的强度（6）。TTA的高激活潜力及其结合位点在PHCMV*_1 [（1）中的排列；参见图ia]建议设计双向启动子，该设计将允许同时调节来自中心位置多个TETO序列的两个转录单元（图la）。这样的启动子对于多种实验方法应该有用。首先，它可以允许以化学计量量的两种基因产物的合成，这通常是产生异二聚体（或异源 - 寡聚）蛋白的先决条件。在这里，我们报告了双向启动子的构建（PBI-L;图第二，通过将不同效率的最小启动子融合到中心位置的TETO序列，可以在不同但定义的水平上共同调节两个基因产物。第三，通过在双向启动子的一侧整合适当的报告基因，可以通过报告基因函数来监测对不可读基因的调节。后一种可能性也可能有助于在细胞和有机水平上 - 筛选正确整合的表达单元，以控制感兴趣的基因。1a）表明，该启动子以定量方式共同调节了编码P-半乳糖苷酶和荧光素酶的两个报告基因。此外，我们描述了一个矢量系列，很容易允许将PBI-I用于各种目的。图1a所示的广义发散转录单元由基因X的双向启动子组成，然后是
靶向染色质编辑揭示的模拟表观遗传记忆
图 2. DNMT3A 编辑细胞中的基因表达动态表明了一种不同于二进制的记忆形式。A 使用与 dCas9、PhlF 或 rTetR 融合的 KRAB、DNMT3A 或 TET1 作为 DNA 结合域 (DBD) 进行瞬时表观遗传编辑的概述。B 本研究开发的实验系统示意图。报告基因通过位点特异性染色体整合整合到内源性哺乳动物基因座中。哺乳动物组成型启动子 (EF1a) 驱动荧光蛋白 EBFP2 的表达。上游结合位点能够靶向募集表观遗传效应物，这些效应物与 DNA 结合蛋白 rTetR、PhlF 或 dCas9 融合。报告基因两侧是染色质绝缘体，以与其他基因隔离。 C 实验概述描述了瞬时转染到带有报告基因的细胞、基于转染水平的荧光激活细胞分选和时间过程流式细胞术测量。D 根据图 C 中显示的实验时间线，DNMT3A 编辑（DNMT3A-dCas9）报告基因的基因表达动态。显示的是 DNMT3A 编辑细胞的单细胞流式细胞术测量（EBFP2）。DNMT3A-dCas9 靶向启动子上游的 5 个靶位点，并使用乱序 gRNA 靶序列作为对照（图 SE.2 A、B、表 S3）。黄色阴影表示检测到转染标记的时间。显示的数据来自 3 个独立重复的代表性重复。E 转染 DNMT3A-dCas9 和细胞分选后 14 天进行 MeDIP-qPCR 和 ChIP-qPCR 分析，以获得高水平的转染。分析了启动子区域（表 S4 和方法）。显示的数据来自三个独立的重复。报告的是使用标准 ∆∆ C t 方法相对于活性状态的倍数变化及其平均值。误差线是平均值的标准差。DNMT3A-dCas9 靶向启动子 (gRNA) 上游的 5 个靶位点。使用乱序的 gRNA 靶序列 (gRNA NT) 作为对照。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，非配对双尾 t 检验。F 根据图 C 中显示的实验时间线的 KRAB 编辑 (PhlF-KRAB) 基因表达动态。显示的是单个细胞的报告基因 (EBFP2) 的流式细胞术测量值。黄色阴影区域表示在未应用 DAPG 期间检测到转染标记的时间。从第 6 天开始，在 PhlF-KRAB 和 PhlF 条件下应用 DAPG。每天测量不同的独立重复。显示的数据来自 3 个独立重复。G 转染 PhlF-KRAB 和高水平转染细胞分选后 6 天的 MeDIP-qPCR 和 ChIP-qPCR 分析。分析的是启动子区域。数据来自三个独立重复。显示的是相对于活性状态的标准 ∆∆ C t 方法确定的倍数变化及其平均值。误差线是平均值的标准差。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，非配对双尾 t 检验。H 当 KRAB = 0、TET1 = 0 时获得的染色质修饰回路。参见 SI 图 SM.1 C。I 上图：(CpGme, X) 对的剂量反应曲线。下图：DNMT3A 脉冲强度与 DNA 甲基化等级 (CpGme) 之间的剂量反应曲线。脉冲强度通过增加其高度来增加。参见 SI 图 SM.1 D 和 SM.3。J 系统基因表达的平稳概率分布，由 SI 表 SM.1 和 SM.4 中列出的反应表示，参数值在 SI 第 S.9.3 节中给出。K 系统在 t = 28 天后的基因表达概率分布，如图 J 所示，参数值和初始条件在 SI 第 S.9.4 节中给出。参见 SI 图 SM.1 B 和 SM.2。在图 I 和 J 中，DNMT3A 动力学被建模为随时间呈指数下降的脉冲（参见第 S.1.1 节 - SI 方程 (SM.7)）。在我们的模型中，ε (ζ) 是衡量基础（招募）擦除率与每次修饰的自催化率之间比率的参数。参见 SI 图 SM.1 E 和 SM.3。
新型抗体药物偶联物的临床前评估（...
IL-13R α 2阴性细胞G361（左）稳定表达萤火虫荧光素酶作为发光报告基因，命名为G361-Luc。将内源性IL-13R α 2表达的A375黑色素瘤癌细胞和G361-Luc细胞混合物（比例=2:1）接种到96孔板中，每孔4000个细胞，用0/0.1/1/10nM抗体处理6天。用Cell-Titer-Glo®活力测定试剂盒评估细胞活力。与人IgG1对照抗体（右）相比，当细胞混合物与0.1/1/10nM的LM-306孵育时观察到明显的旁观者效应。
通过分级DNA甲基化的模拟表观遗传细胞记忆
图2。DNMT3A募集后的基因表达动力学与数字记忆不一致。使用特定于特定于染色体的染色体整合的169个报告基因基因的示意图。哺乳动物170构成启动子（EF1A）驱动荧光蛋白EBFP2的表达。上游结合位点可实现靶向171的表观遗传效应子，该效应子与DNA结合蛋白RTETR融合在一起，PHLF或DCAS9。报告基因是由染色质绝缘子与其他基因分离出来的172。b实验概述，描述了瞬时转染到具有报告基因的173个细胞，基于转染水平的荧光激活的细胞分选，以及时间顺序的流量细胞仪174测量。根据面板中所示的175个实验时间表。显示的是四种不同水平的转染水平的报告基因176（EBFP2）的流量细胞仪测量值的分布。DNMT3A-DCAS9靶向启动子上游的5个目标位点，177用作炒GRNA目标序列作为对照（图se.2 a，b，表S3）。显示的数据来自来自3个独立重复的代表性178重复。d使用DNMT3A-179的流量细胞仪的单细胞基因表达测量值对应于面板C中所示的细胞（30天）。父母是指带有180个报告基因的未转染细胞。数据来自3个独立重复的代表性重复。平均值。e MedIP-QPCR和ChIP-QPCR 181分析DNMT3A-DCAS9和细胞分类后14天分析高水平的转染。分析了启动子区域182。显示的数据来自三个独立的重复。报道的是折叠变化及其平均值，使用183标准∆ ∆ c t方法相对于活性状态。错误条为S.D.DNMT3A-DCAS9的靶向位置为184至5个目标位点（GRNA）。使用炒GRNA目标序列（GRNA NT）作为对照。185 *p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，未配对的两尾t检验。根据面板中所示的实验时间线，krab抑制的基因表达动力学（PHLF-KRAB）186。所示是从四种不同水平的转染水平的187个报告基因基因（EBFP2）的流量细胞仪测量值的分布。每天测量一个独立的重复。显示的数据188来自3个独立重复。g重新激活细胞的百分比（400-10 5基因表达A.U.F.）对应于F. h Medip-QPCR面板中显示的189个细胞种群和CHIP-QPCR分析后6天对PHLF-KRAB和Cell 190排序进行了高水平的转染。分析是启动子区域的。数据来自三个独立的重复。191显示的是折叠变化，其平均值由标准∆ΔCT方法确定相对于活性状态。错误192条是S.D.平均值。p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，未配对的两尾t检验。参见SI图参见Si无花果。202i简化染色质修饰193当krab = 0，dnmt3a = 0，tet1 = 0时获得的电路图，而H3K9me3并未介导从头催化194 DNA甲基化的催化。SM.1 C. J顶图：（CPGME，H3K4ME3）对的剂量响应曲线。底部图：（DNMT3A，CPGME）对的剂量-195响应曲线。SM.1 D和SM.3。 k k的基因表达的概率分布196的系统，该系统由Si Tape Sm.1和Sm.3中列出的反应表示。 参见Si无花果。 SM.1 B和SM.2。 l概率197在t = 28天后的基因表达分布，如面板I所述获得。 在小组j和l中，将198 DNMT3A动力学建模为脉冲，随着时间的流逝会呈指数减小。 在我们的模型中，α'是通过抑制组蛋白修饰的DNA甲基化建立的归一化速率199，DNA甲基化擦除率200速率与激活组蛋白的擦除速率和激活的组蛋白修改速率之间的µ'是每个基准级别（ε'）的级别（均为基础率（均））（招募）（招募）（招募）。修改。 参见SI图 SM.1 E和SM.3。SM.1 D和SM.3。k k的基因表达的概率分布196的系统，该系统由Si Tape Sm.1和Sm.3中列出的反应表示。参见Si无花果。SM.1 B和SM.2。 l概率197在t = 28天后的基因表达分布，如面板I所述获得。SM.1 B和SM.2。l概率197在t = 28天后的基因表达分布，如面板I所述获得。在小组j和l中，将198 DNMT3A动力学建模为脉冲，随着时间的流逝会呈指数减小。在我们的模型中，α'是通过抑制组蛋白修饰的DNA甲基化建立的归一化速率199，DNA甲基化擦除率200速率与激活组蛋白的擦除速率和激活的组蛋白修改速率之间的µ'是每个基准级别（ε'）的级别（均为基础率（均））（招募）（招募）（招募）。修改。参见SI图SM.1 E和SM.3。SM.1 E和SM.3。
禽白血病病毒 J 亚群对生物技术诱导的宿主抗性的快速适应性进化
使用 CRISPR/Cas9 技术对生殖系进行基因编辑，可以改变牲畜性状，包括产生对病毒性疾病的抗性。然而，病毒的适应性可能是这一努力的主要障碍。最近，通过使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑删除 ALV-J 受体 NHE1 中的单个氨基酸 W38，开发出了对禽白血病病毒亚群 J (ALV-J) 具有抗性的鸡。这种抗性在体外和体内均得到了证实。体外显示 W38 -/- 鸡胚胎成纤维细胞对所有测试的 ALV-J 菌株具有抗性。为了研究 ALV-J 进一步适应的能力，我们使用了基于逆转录病毒报告基因的检测来选择适应的 ALV-J 变体。我们假设克服细胞抗性的适应性突变会发生在包膜蛋白中。根据这一假设，我们分离并测序了大量适应的病毒变体，并在它们的包膜基因中发现了八个独立的单核苷酸替换。为了确认这些替换的适应能力，我们将它们引入原始的逆转录病毒报告基因中。所有八个变体在体外都能在 W38 -/- 鸡胚胎成纤维细胞中有效复制，而在体内，W38 -/- 鸡对其中两个变体诱导的肿瘤敏感。重要的是，具有更广泛修改的受体等位基因仍然对病毒具有抵抗力。这些结果证明了牲畜基因组工程中实现抗病毒抗性的重要策略，并说明由较小受体修改引起的细胞抗性可以通过适应的病毒变体来克服。我们得出结论，需要更复杂的编辑才能获得强大的抵抗力。
使用 AAV 介导的原位基因标记可视化哺乳动物大脑中的 Arc 蛋白动力学和定位
活性调节的细胞骨架相关 (Arc) 蛋白对于突触可塑性和记忆形成至关重要。Arc 基因含有结构 GAG 逆转录转座子序列的残余，它产生的蛋白质可自组装成含有 Arc mRNA 的衣壳状结构。从神经元释放的 Arc 衣壳已被提议作为一种新的 mRNA 传递细胞间机制。尽管如此，仍然缺乏 Arc 在哺乳动物大脑中细胞间运输的证据。为了能够在体内追踪来自单个神经元的 Arc 分子，我们设计了一种腺相关病毒 (AAV) 介导的方法，使用 CRISPR/Cas9 同源独立靶向整合 (HITI) 将荧光报告基因标记到小鼠 Arc 蛋白的 N 端。我们表明，编码 mCherry 的序列可以成功敲入 Arc 开放阅读框的 5′ 端。虽然 Arc 起始密码子周围有 9 个 spCas9 基因编辑位点，但编辑的准确性高度依赖于序列，只有一个靶标导致框内报告基因整合。在海马中诱导长期增强 (LTP) 时，我们观察到 Arc 蛋白的增加与荧光强度和 mCherry 阳性细胞数量的增加高度相关。通过邻近连接分析 (PLA)，我们证明 mCherry-Arc 融合蛋白通过与突触后棘中的跨膜蛋白 stargazin 相互作用而保留了 Arc 功能。最后，我们在靠近编辑神经元的 mCherry 阳性棘的 mCherry 阴性周围神经元中记录了 mCherry-Arc 与突触前蛋白 Bassoon 的相互作用。这是第一项为哺乳动物大脑中 Arc 的神经元间体内转移提供支持的研究。
从进化的角度看分子伴侣介导的自噬
分子伴侣介导的自噬 (CMA) 是溶酶体蛋白水解的主要途径，被认为是控制多种细胞功能的关键因素，其缺陷与多种人类疾病有关。迄今为止，由于非四足动物缺乏可识别的溶酶体相关膜蛋白 2A (LAMP2A)，而 LAMP2A 是 CMA 的限制和必需蛋白，因此推测这种细胞功能仅限于哺乳动物和鸟类。然而，最近在几种鱼类中发现的表达序列与哺乳动物 LAMP2A 具有高度同源性，这挑战了这种观点，并表明 CMA 在进化过程中出现的时间可能比最初认为的要早。在本研究中，我们全面描述了脊椎动物中 LAMP2 基因的进化史，并证明 LAMP2 确实出现在脊椎动物谱系的根源中。利用青鳉 (Oryzias latipes) 的成纤维细胞系，我们进一步表明，剪接变体 lamp2a 在长期饥饿状态下控制着一种荧光报告基因在溶酶体中的积累，这种荧光报告基因通常用于追踪哺乳动物细胞中的 CMA。最后，为了阐明 Lamp2a 在鱼类中的生理作用，我们生成了该特定剪接变体的敲除青鳉，并发现这些缺陷鱼的碳水化合物和脂肪代谢发生了严重改变，这与肝脏中缺乏 CMA 的小鼠的现有数据一致。总之，我们的数据为鱼类中存在 CMA 样通路提供了第一个证据，并为使用互补遗传模型（如斑马鱼或青鳉）从进化角度研究 CMA 带来了新视角。
T231E突变体，在阿尔茨海默氏病中模仿Tau的病理磷酸化会导致线粒体展开的蛋白质反应激活I
触摸神经元。CRISPR-CAS9基因编辑用于将磷酸化T231A，磷酸化模拟T231E和乙酰基模拟的K274/281Q突变引入Tain4 Orf。为简单起见，这些突变体将称为T231A，T231E和K274/281Q。（b，c）第3天的触摸神经元的荧光图像，表达dendra2 :: Taut4转化融合和T231E突变体的单拷贝转基因编码。虚拟的圆圈表示PLM细胞体的位置，显示在插图中。比例尺，0.5 µm。注意，斑点荧光来自后肠中标记为GFP的HSP-60表达式。（c，d）成年第3和第10天，对面板A中列出的菌株的PLM细胞体荧光定量。数据是来自两个独立技术重复的平均值±SD。各个数据点从单独动物的单个PLM细胞中划分值（n = 25±5）。统计分析是通过Tukey的事后测试进行的双向方差分析，在比较包围样品时，*** p <0.001。请注意，左侧条形柱是指单独携带Dendra2报告基因的转基因菌株的荧光定量，而右侧则是指携带Dendra2和HSP-60记者的菌株。（e）表达整合的UPR MT报告基因P HSP-60 :: GFP和单拷贝MOSSCI插入的转基因蠕虫的代表性荧光图像。比例尺，0.5毫米。数据是平均±SD（来自两个独立生物学重复的20只动物）。（f）从面板中列出的菌株的后肠道区域中荧光信号强度定量。ns表示不显着，如通过单向方差分析计算，然后进行Tukey的多重比较测试。