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ACSBG1 在脑脂质代谢和 X 连锁肾上腺脑白质营养不良发病机制中的作用：来自基因敲除小鼠模型的见解
摘要：“泡泡糖”酰基辅酶 A 合成酶 (ACSBG1) 是小鼠大脑发育过程中脂质代谢的关键因素，可促进长链脂肪酸 (LCFA) 的激活及其与对大脑功能至关重要的脂质种类的结合。ACSBG1 将 LCFA 转化为酰基辅酶 A 衍生物，支持重要的代谢过程。缺乏 ACSBG1 的果蝇突变体表现出神经退化，并且极长链脂肪酸 (VLCFA) 水平升高，这是人类 X 连锁肾上腺脑白质营养不良 (XALD) 的特征。为了探索 ACSBG1 的功能和作为 XALD 治疗靶点的潜力，我们创建了 ACSBG1 敲除 (Acsbg1 − / − ) 小鼠并检查了其在发育过程中对大脑 FA 代谢的影响。从表型上看，Acsbg1 − / − 小鼠与野生型 (wt) 小鼠相似。 ACSBG1 表达主要出现在 XALD 病理受影响的组织中，即大脑、肾上腺和睾丸。ACSBG1 耗竭并未显著降低这些组织类型中的总 ACS 酶活性。在成年小鼠大脑中，ACSBG1 表达在小脑中最高；在生命第一周内检测到的低水平此后急剧增加。出乎意料的是，Acsbg1 − / − 与 wt 小鼠相比，小脑中的饱和 VLCFA 水平较低，而不是较高，尤其是在一周龄之后。野生型和 Acsbg1 − / − 小鼠的单不饱和 ω 9 FA 和多不饱和 ω 3 FA 水平的发育变化也不同。ACSBG1 缺乏会影响几种小脑 FA 代谢酶的发育表达，包括合成 ω 3 多不饱和 FA 所需的酶，ω 3 多不饱和 FA 是生物活性信号分子（如二十烷酸和二十二碳烯酸）的前体。膜脂质 FA 组成的这些变化可能会影响膜流动性，从而影响身体对炎症的反应。我们得出结论，尽管有令人信服的间接证据，但 ACSBG1 不太可能直接导致 XALD 病理，从而降低了其作为治疗靶点的潜力。相反，应进一步研究 ACSBG1 敲除对由二十烷酸和/或二十二碳烯酸调节的过程的影响。
使用整合和抗 CRISPR (IntAC) 在果蝇细胞中进行更高分辨率的全基因组 CRISPR 敲除筛选
2 霍华德休斯医学研究所，波士顿，MA 02115 通信：ram@genetics.med.harvard.edu (RV)；perrimon@genetics.med.harvard.edu (NP) 摘要 CRISPR 筛选可实现系统的、可扩展的基因型到表型映射。我们之前开发了一种用于果蝇和蚊子细胞系的汇集 CRISPR 筛选方法，使用质粒转染和位点特异性整合来引入单向导 (sgRNA) 文库，然后进行 PCR 和整合的 sgRNA 测序。虽然有效，但该方法依赖于早期组成型 Cas9 活性，这可能会导致基因组编辑和 PCR 检测到的 sgRNA 之间存在差异，从而降低筛选准确性。为了解决这个问题，我们引入了一种新方法来共转染表达抗 CRISPR 蛋白 AcrIIa4 的质粒以抑制早期 sgRNA 表达期间的 Cas9 活性，我们称之为“IntAC”（与抗 CRISPR 整合酶）。 IntAC 使我们能够构建一种由高强度 dU6:3 启动子驱动的新型 CRISPR 筛选方法。这个新库显著提高了整个基因组中适应性基因的精确度，在 5% 的误差范围内检索了 90-95% 的必需基因组，使我们能够生成迄今为止为果蝇组装的最全面的细胞适应性基因列表。我们的分析确定，IntAC 方法允许的升高的 sgRNA 水平推动了大部分改进。果蝇适应性基因与人类适应性基因表现出很强的相关性，并强调了旁系同源物对基因必需性的影响。我们进一步证明，IntAC 与靶向 sgRNA 子库相结合，能够在溶质超载下精确地正向选择转运蛋白。IntAC 是对现有果蝇 CRISPR 筛选方法的直接增强，显著提高了准确性，并且可能广泛应用于其他细胞类型（包括蚊子、鳞翅目、蜱虫和哺乳动物细胞）中的无病毒 CRISPR 筛选。
丝状真菌基因敲除技术研究进展
丝状真菌表现出良好的经济价值，因为它具有生产各种活性天然化合物的能力。丝状真菌的遗传背景相对复杂，并且使用遗传工程来修饰丝状真菌相对较晚。基因敲除是修饰丝状真菌的重要方法之一。基因敲除技术可以阐明基因的功能，并有效阻断或削弱旁路代谢途径，从而将代谢通量集中到目标产物。本综述着重于丝状真菌的价值和研究进度，并介绍了用于丝状敲除基因敲除
番茄中 SlDMR6-1 的敲除促进了抗旱...
霜霉病抗性 6 (DMR6) 蛋白是一种 2-氧戊二酸 (2OG) 和 Fe(II) 依赖性加氧酶，参与水杨酸 (SA) 代谢。SA 被认为是一种非生物胁迫耐受性增强剂，在番茄中发现 DMR6 的失活会增加其水平并诱导对多种病原体的抗病性。通过应用 CRISPR/Cas9 技术，我们生成了 Sldmr6-1 番茄突变体并测试了它们对干旱和晚疫病的耐受性。野生型番茄品种‘San Marzano’及其 Sldmr6-1 突变体被剥夺了 7 天的水。WT植物表现出严重的枯萎，而T 2 Sldmr6-1突变体叶片肿胀，并保持较高的土壤相对含水量。生态生理测量表明，Sldmr6-1突变体采取了节水行为，通过降低气孔导度来降低蒸腾速率。在干旱胁迫下，同化率也降低，导致气孔下腔中的CO 2浓度没有改变，并提高了水分利用效率。此外，在Sldmr6-1突变体中，干旱胁迫诱导抗氧化相关基因SlAPX和SlGST的上调以及参与ABA分解代谢的SlCYP707A2基因的下调。最后，我们首次在番茄中强调，Sldmr6-1 突变体对晚疫病的病原菌致病菌的敏感性降低。
全基因组CRISPR敲除屏幕揭示了猪基因组中必需基因的景观
（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此预印本版的版权持有人于2024年8月1日发布。 https://doi.org/10.1101/2024.08.01.606235 doi：biorxiv preprint
遗传基因敲除表明bollworm helicoverpa Zea中的ABCC2蛋白不是CRY1AC杀虫蛋白的主要受体
摘要：昆虫ATP结合的盒式转运蛋白亚家族C2（ABCC2）的成员被称为苏皮鲁西斯芽孢杆菌（BT）的Cry1ac杀虫蛋白的受体。废除ABCC2功能结构域的突变已知会引起对Cry1ac的抗性，尽管报告的抗药性水平取决于昆虫物种的差异很大。在这项研究中，使用CRISPR/CAS9评估了ABCC2基因作为Helicoverpa Zea的推定CRY1AC受体的功能，该受体的主要有害生物是300多种农作物，以逐步消除不同的功能性ABCC2域。来自具有编辑昆虫线支持的生物测定结果，即ABCC2中的突变与7.3至39.8倍的CRY1AC耐药比（RR）有关。在部分或完全的ABCC2敲除之间检测到H. Zea之间对Cry1ac的敏感性的显着差异，尽管在敲除ABCC2的一半时观察到了最高的公差水平。基于在类似的研究中针对密切相关的飞蛾物种的类似研究中报道的> 500–1000倍的RR，在H. Zea敲除中观察到的低RR支持ABCC2不是该昆虫中主要的Cry1ac受体。
PARG 敲除 MDA-MB-231 细胞系
描述 PARG 敲除 MDA-MB-231 细胞系是一种 MDA-MB-231 细胞系，其中人类 PARG（聚 ADP-核糖糖水解酶）长同工酶（PARG111、PARG102 和 PARG99）已使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑从基因上去除，慢病毒编码 CRISPR/Cas9 基因和针对人类 PARG 的 sgRNA（单向导 RNA）。该细胞系已通过基因组测序和蛋白质印迹分析验证。背景聚（ADP-核糖）糖水解酶 (PARG) 是一种分解代谢酶，参与 PARylated 链的降解，释放 ADP-核糖和寡（ADP-核糖）链。 PAR（聚 ADP 核糖基化）稳态由 PAR 聚合酶 (PARP) 家族和 PARG 调节，以响应细胞应激条件，例如 DNA 损伤反应 (DDR)。PARG 活性与炎症、缺血、中风和癌症中的细胞反应有关。PARG 在乳腺癌中过度表达，与肿瘤生长和存活有关。PARG 活性降低可以增强当前癌症疗法（例如化疗和放疗）的效果，使 PARG 选择性抑制剂抑制成为癌症和免疫疗法中一种有前途的方法。MDA-MB-231 是一种源自乳腺腺癌的上皮细胞系，具有突变的 p53。它是 ER（雌激素受体）、HER2 和 E-钙粘蛋白阴性，用作晚期乳腺癌的模型。应用
Taf1 敲除对胚胎雄性小鼠是致命的，杂合雌性表现出体重和运动障碍
TATA 盒结合蛋白相关因子 1 (TAF1) 是一种普遍表达的蛋白质，也是基础转录因子 TFIID 的最大亚基，在 RNA 聚合酶 II 依赖性转录的启动中起关键作用。人类男性中的 TAF1 错义变异会导致 X 连锁智力障碍（一种神经发育障碍），并且 TAF1 在 X 连锁肌张力障碍（一种神经退行性疾病，帕金森病）中失调。然而，该领域缺乏 TAF1 疾病的遗传小鼠模型来探索其在哺乳动物和治疗中的机制。在这里，我们生成并验证了条件性 cre-lox 等位基因和第一个普遍存在的 Taf1 敲除小鼠。我们发现雄性小鼠的 Taf1 缺失是胚胎致死的，这可能解释了为什么在人类中没有发现无效变体。在 Taf1 杂合雌性小鼠的大脑中，总体结构、整体表达和蛋白质定位没有发现差异，表明 X 失活极度偏向非突变染色体。尽管如此，这些雌性小鼠的体重显著增加，体重随年龄增长而增加，运动减少，这表明一小部分神经元受到 Taf1 缺失的负面影响。最后，这种新的小鼠模型可能是开发 TAF1 疾病治疗的未来平台。
基因敲除试剂盒
我们强烈建议您在使用靶向特异性多向导 sgRNA 之前，先使用特定细胞类型的阳性对照优化转染条件。为了优化人类细胞系的条件，EditCo 提供了转染优化试剂盒，其中包含靶向人类 TRAC 的阳性对照多向导 sgRNA。对于小鼠细胞系，我们建议使用靶向小鼠 Rosa26 的阳性对照单向导 sgRNA 来优化您的条件（请参阅第 2 页所需的其他材料）。我们建议为您的基因组编辑实验形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物，以最大限度地提高编辑效率并减少脱靶效应。选择 EditCo 的电穿孔、脂质转染或核转染方案与此试剂盒一起使用。所有方案均可在 editco.com/resources 上找到。
CRISPR-Cas9 敲除筛选确定 DNA 损伤反应途径和 BTK 对弥漫大 B 细胞淋巴瘤顺铂反应至关重要
简单总结：弥漫大 B 细胞淋巴瘤是最常见的淋巴瘤类型。尽管接受了初始治疗，但多达 40% 的患者未能治愈，需要二线治疗。对于那些经历晚期复发或无法获得 CAR-T 细胞疗法的患者，以铂类为基础的化疗后进行干细胞移植仍然是标准治疗方法。在这项研究中，我们使用全基因组 CRISPR/Cas9 筛选和单基因敲除实验来识别与对铂类药物的反应相关的基因。我们提供了与 DLBCL 对顺铂的反应有关的基因的综合列表。我们的功能实验强调了 DNA 损伤反应基因 XPA 和 ERCC6 以及 BTK 在对铂类药物的反应中的关键作用。此外，我们还表明，抑制较低浓度的 BTK 会使 DLBCL 细胞对铂类药物敏感。