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耦合CRISPR/Cas9和Lambda Red重组工程系统对鸡沙门氏菌进行基因组编辑及ssaU敲除突变体对细菌毒力的影响
摘要：发展中国家的养禽业仍然面临着鸡伤寒的巨大威胁，这种疾病由鸡沙门氏菌引起，在经济较发达国家已得到较好的控制。除了大型毒力质粒 (85 kb) 表现出的毒力外，鸡沙门氏菌致病岛 2 还通过其 III 型分泌系统 (TTSS) 在介导疾病方面发挥关键作用。TTSS 分泌效应蛋白穿过含有沙门氏菌的液泡，并通过调节囊泡通道介导细菌的内化。在本研究中，使用 CRISPR/Cas9 和 lambda 重组系统通过同源定向修复，成功从本土分离的鸡沙门氏菌基因组中删除编码 III 型分泌系统的候选毒性 ssaU 基因 (~1 kb)。基于 CRISPR/Cas9 的家禽鸡沙门氏菌基因组编辑此前尚未见报道，这可能与其遗传工具效率低下有关。这是首次展示从该细菌基因组中完全进行基于 CRISPR/Cas9 的基因删除的研究。更重要的是，采用家禽实验模型评估了该突变菌株 (∆ ssaU_ S G18) 的毒力潜力，与野生型菌株相比，该突变菌株无法在实验攻毒的鸟类中产生任何死亡率。在我们的攻毒模型中，没有观察到对体重增加的影响，而细菌无法在肠道和肝脏中定植。突变菌株体内毒力的丧失使该系统具有出色的功能，可用于开发针对这种耐药性和致病性细菌的活疫苗。
基于 CRISPR/Cas9 的 PMR4 基因敲除降低了两种番茄品种对晚疫病的易感性
摘要：番茄晚疫病（LB）的病原菌是致病疫霉菌，是一种毁灭性的疾病，严重影响植物的生产力。植物中易感基因（S）的存在促进了病原菌的增殖；因此，抑制这些基因可能有助于提供广谱和持久的耐受性/抗性。先前对拟南芥和番茄的研究表明，PMR4 易感基因的敲除突变体对白粉病具有耐受性。此外，马铃薯中 PMR4 的敲低已被证明可以赋予对 LB 的耐受性。为了在本研究中验证番茄中的相同效果，将含有四个单向导 RNA（sgRNA：sgRNA1、sgRNA6、sgRNA7 和 sgRNA8）的 CRISPR-Cas9 载体（靶向尽可能多的 SlPMR4 区域）通过农杆菌介导的转化引入两种广泛种植的意大利番茄品种：“San Marzano”（SM）和“Oxheart”（OX）。选择了 35 株植物（26 株 SM 和 9 株 OX）并进行筛选，以确定 CRISPR/Cas9 诱导的突变。不同的 sgRNA 导致的突变频率范围从 22.1% 到 100%，或者精确插入（sgRNA6）或缺失（sgRNA7、sgRNA1 和 sgRNA8）。值得注意的是，sgRNA7 在七种 SM 基因型中诱导了纯合状态下的 − 7 bp 缺失，而 sgRNA8 导致产生十五种具有双等位基因突变（ − 7 bp 和 − 2 bp）的 SM 基因型。选定的编辑品系接种了 P. infestans，其中四种在 PMR4 基因座完全敲除的品系与对照植物相比表现出减轻的病害症状（易感性从 55% 降低到 80%）。使用 Illumina 全基因组测序对四种 SM 品系进行测序以进行更深入的表征，而未显示出候选脱靶区域发生任何突变的证据。我们的结果首次表明，pmr4 番茄突变体对致病疫霉菌的易感性降低，证实了 KO PMR4 在提供针对病原体的广谱保护中的作用。
CRISPR/CAS9对NOX4敲除对MCF-7，HCA-7和UM-RC-6癌细胞的影响
微生物免疫反应，但在癌症中看到它们过多的表达（9）。NOX4是一种生成的NOX同工型，对于H 2 O 2产生至关重要，属于NOX类（10）；最近的研究报告说，NOX4参与了许多癌症（12、13）。尽管没有阐明NOX4调节癌细胞增殖，迁移和存活的机制，但一些研究表明，NOX 4通过细胞周期调节和凋亡抑制导致细胞增殖（14，15）。随着分子生物学的进步，基因组编辑技术可以改变基因组并观察到遗传调节引起的功能变化。多种方法已用于治疗影响身体正常细胞的恶性肿瘤。然而，需要进一步尝试使用分子生物学发展癌症和肿瘤治疗方法（16）。最近，与定期间隔的聚类相关的CAS 9蛋白质系统使用了短暂的alindromic重复序列（CRISPR）来减少由癌症作为一种新型治疗和强大技术引起的死亡，具有高精度和效率的治疗癌症（17）。
CRISPR/Cas9 介导的 HuTu-80 和 HEK 293T 细胞系中的 LRP10 敲除
在患有家族性帕金森病 (PD)、帕金森病性痴呆 (PDD) 和路易体痴呆 (DLB) 的患者中，已发现低密度脂蛋白相关蛋白 10 基因 (LRP10) 中罕见的致病变异 (Quadri et al., 2018)。此外，对携带不同 LRP10 变异的患者的尸检分析显示，脑干、边缘和皮质区域中存在严重的 α-突触核蛋白相关病理负担，表现为路易体 (LB) 和路易体神经突 (LN) (Quadri et al., 2018)。重要的是，功能研究表明，最初发现的 LRP10 致病变异影响 LRP10 转录本表达和稳定性、蛋白质稳定性或蛋白质定位，表明功能丧失 (LoF) 是一种共同的致病机制 (Quadri et al., 2018)。此外，早期使用 LRP10 过表达模型的研究报告称 LRP10 参与细胞内运输途径 (Boucher et al., 2008; Brodeur et al., 2009, 2012; Doray et al., 2008). 尽管有这些数据，但对于内源性 LRP10 在健康和疾病中的功能知之甚少，部分原因是缺乏体外 LRP10 敲除 (KO) 模型。
TCR 敲除 Jurkat 细胞系
描述 TCR 敲除 Jurkat 细胞系是通过 CRISPR/Cas9 基因组编辑生成的，以去除 TCRα 和 β 链的 TRAC（T 细胞受体 Alpha 常数）和 TRBC1（T 细胞受体 β 常数 1）结构域。背景 T 细胞受体 (TCR) 位于 T 细胞表面，负责识别与 MHC（主要组织相容性复合体）分子结合的抗原。TCR 的参与会启动下游 NFAT 信号传导，从而导致 T 细胞活化。TCR 由两种不同蛋白质链的异二聚体组成，其中 alpha（α）和 beta（β）链是主要链。CRISPR/Cas9 基因组编辑用于去除 α 和 β 链的 TRAC（T 细胞受体 Alpha 常数）和 TRBC1（T 细胞受体 β 常数 1）区域，导致 TCR 表达丧失。应用 在生成或表征 CAR-T 细胞时用作对照 提供的材料
CRISPR 介导的 TGFBR2 敲除使人类卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞对 TGF-β 信号产生抗性
摘要 背景 卵巢癌 (OvCa) 患者 T 细胞浸润升高与生存率提高之间的相关性表明内源性肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 具有一定程度的抗肿瘤活性，可用于 OvCa 免疫治疗。我们之前优化了一种体外 OvCa TIL 扩增用于过继细胞疗法的方案，该方案目前正在我们机构的临床试验中进行测试 (NCT03610490)。在此成功的基础上，我们开始对 OvCa TIL 进行基因改造，以克服肿瘤微环境中存在的关键免疫抑制因素。在这里，我们介绍了在患者来源的 OvCa TIL 中 CRISPR/Cas9 介导的 TGF-β 受体 2 (TGFBR2) 敲除的临床前优化。方法 从四名患者手术切除的肿瘤样本中生成 OvCa TIL，并进行 CRISPR/Cas9 介导的 TGFBR2 敲除，然后进行快速扩增方案。全面评估了 TGFBR2 定向 gRNA 的 TGFBR2 敲除效率和脱靶活性。此外，还测定了 TGFBR2 敲除对 TIL 扩增、功能和下游信号传导的影响。结果在四个独立的 OvCa TIL 样本中测试的 5 个 gRNA 实现了从 59±6% 到 100%±0% 的 TGFBR2 敲除效率。TGFBR2 敲除的 TIL 对免疫抑制 TGF-β 信号传导具有抗性，表现为缺乏 SMAD 磷酸化、缺乏对 TGF-β 刺激的整体转录变化、在有和没有 TGF-β 的情况下促炎细胞因子的分泌同样强烈、并且在存在 TGF-β 的情况下细胞毒性增强。CRISPR 修饰本身不会改变 OvCa TIL 的体外扩增效率、免疫表型或 TCR 克隆多样性。对于临床转化而言，重要的是，对 CRISPR 脱靶效应的全面分析表明，我们前两个靶向 TGFBR2 的 gRNA 没有脱靶活性的证据。结论 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除在患者来源的 OvCa TIL 中是可行且有效的，可使用临床可扩展的方法。我们实现了高效且特异性的 TGFBR2 敲除，产生了一种扩增的 OvCa TIL 产品，该产品对免疫抑制剂具有抗性
甲藻基因敲除策略
摘要：甲藻是单细胞原生生物，具有不寻常的核特征，例如基因组大、染色体浓缩和以串联基因阵列形式组织的多个基因拷贝。人们认为遗传调控是在翻译水平而非转录水平上控制的。这一过程中的一个重要参与者是起始因子 eIF4E，它与 mRNA 5' 端的 7-甲基鸟苷帽结构 (m7G) 结合。对 11 种甲藻物种的转录组分析表明，每种物种编码 8 到 15 个 eIF4E 家族成员。确定 eIF4E 家族成员在基因表达中的作用需要一种抑制其表达的方法。在其他真核生物中，这可以使用与 RNA 互补链结合的翻译阻断吗啉来实现，从而抑制 mRNA 加工。以前，未经修饰的吗啉缺乏穿过细胞膜的能力，但是肽基试剂已被用于通过内吞介导的过程将物质递送到细胞的细胞质中，而不会损坏细胞膜。我们已成功使用特定的细胞穿透肽将荧光标记的吗啉递送到 Amphidinium carterae 的细胞质中，目标是靶向 eIF4e-1a 序列以抑制翻译。特定的 eIF4e 敲除成功率（高达 42%）已通过显微镜和蛋白质印迹分析进行鉴定。
基于 CRISPR-del 的人类基因完全敲除流程 1
。CC-BY-NC 4.0 国际许可，根据 （未经同行评审认证）提供，是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者，此版本于 2022 年 5 月 27 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.06.21.449335 doi：bioRxiv 预印本
crispr/cas9介导的T7 RNA聚合酶基因敲除...
摘要欧洲传统的武器控制建筑正在崩溃。本文认为，经典的武器控制理论无法解释这一持续的过程。我建议，基于互惠和预防战争的技术措施，其潜在的稳定范式已经阻止了对实际的武器控制实践的全面了解，尤其是在欧洲。在这种情况下，我说明了有规律的武器控制已在三个历史阶段发展。在每种情况下，国家参与者都根据具体的地理战略状况来追求不同的理想类型目的：追求政治军事优势，正式创造危机稳定性以及国际关系的转变。在过去十年中，总体政治重点再次转移到了第一个因素。在新的战略竞争中，各州越来越不愿同意控制法规和透明度措施，因为这些措施可能会给对手带来优势。