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World File Search System敲除
仅敲除 LincRNA#1 不会影响凯尔特 POLLED 等位基因杂合牛的无角表型
长基因间非编码 RNA（lincRNA#1）在无角牛胎儿的角芽区过度表达，表明其可能在角芽抑制中发挥作用。使用基因组编辑来测试此序列的缺失是否与角表型有关。将两个具有高突变效率的 gRNA 靶向 lincRNA#1 序列两侧的 5′ 和 3′ 区域，在授精后 6 小时与 Cas9 一起作为核糖核蛋白复合物注射到牛受精卵（n = 121）中。在产生的囊胚（n = 31）中，84% 具有预期的 3.7 kb 缺失；在这些具有 3.7 kb 缺失的胚胎中，88% 是双等位基因敲除。将 39 个推测已编辑的 7 天囊胚移植到 13 头同步受体母牛体内，导致 10 例妊娠，其中 5 个胚胎在 POLLED 基因座上为显性 PC POLLED 等位基因杂合子，5 个胚胎为隐性 pp 基因型。产生的胎儿中有 8 个 (80%) 为双等位基因 lincRNA#1 敲除，其余两个为嵌合体。RT-qPCR 分析用于确认敲除胎儿中不存在 lincRNA#1 表达。对基因型 (PC p) POLLED 、lincRNA#1 敲除胎儿的表型和组织学分析显示，其形态与未编辑的对照无角胎儿相似，表明仅缺乏 lincRNA#1 不会导致有角表型。
转录因子的基因沉默，敲除和过表达
摘要背景：番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球经济上有价值的作物。由于使用无菌性雄性会降低F1种子产量的成本，因此男性不育的创新对于番茄育种具有重要意义。中止的微孢子基因（AMS）编码为基本的螺旋 - 环螺旋（BHLH）转录因子编码，以前已被指定为拟南芥和水稻中tape虫发育的必不可少的基因。确定SLAM基因的功能（来自S. lycopersicum的AMS基因），并验证它是否是产生番茄中雄性无菌性的潜在候选基因，我们使用病毒诱导的基因沉默（VIGS），CRIS/CAS9介导的介导的基因组编辑和过度表达技术来通过AgrobstermaTer transfote transfortium tomato tonrestim tonrection tonrys tomato。结果：在这里，来自S. lycopersimum的1806 bp的全长猛击基因（登录号MK591950.1）从花粉cDNA克隆。花粉颗粒染色的结果表明，猛击的不可行的花粉比例 - 沉默（75％）， - 敲除（89％）和超过表达植物（60％）明显高于野生型植物（小于10％； p <0.01）。在三种情况下，不可生存的花粉颗粒的形态似乎是四方，循环，萎缩，萎缩或以其他方式形状的形态，而野生型的形态则显得椭圆形和丰满。更重要的是，QRT-PCR分析表明，在大满贯和敲除的植物的花药中的猛击的表达明显低于野生型的表达（p <0.01），但在大量过表达的植物中的表达（p <0.01）（p <0.01）。
基于突变独立的 CRISPR/Cas9“敲除...
视紫红质 (RHO) • 一种参与视杆细胞视觉光传导的光敏受体蛋白 • 位于视杆细胞的外节 • 大约 30%（美国和英国）的 adRP 由 RHO 显性突变引起 • 患病率：美国有 7,500 名患者，欧盟和英国有 12,100 名患者 • RHO 基因中发现的 >150 个突变导致 RHO-adRP 1
利用 CRISPR/Cas9 靶向敲除水稻易感基因 OsDjA2 和 OsERF104 揭示稻瘟病抗性的替代来源
Fabiano TPKT ÁVORA 1, 2 , Anne Cécile MEUNIER 3, 4 , Aurore V ERNET 3, 4 , Murielle P ORTEFAIX 3, 4 , Joëlle M ILAZZO 5, 6 , Henri A DREIT 5, 6 , Didier T HARREAU 5, 6 , Octávio L. FRANCO 7, 8 , Angela M EHTA 2 ( 1 巴西茹伊斯迪福拉联邦大学遗传学与生物技术系，茹伊斯迪福拉-MG 36036330，巴西； 2 巴西农业技术公司遗传资源与生物技术，巴西利亚-DF 70770-917，巴西； 3 CIRAD，UMR AGAP 34398 Montpellier Cedex 5，法国； 4 蒙彼利埃大学，CIRAD-INRAe-Institut Agro，蒙彼利埃 34000，法国；5 CIRAD，UMR PIM，TA A120/K，F 34398，蒙彼利埃，法国；6 蒙彼利埃植物健康研究所 - PHIM，蒙彼利埃大学，CIRAD，INRA，IRD，蒙彼利埃 SupAgro，蒙彼利埃 34398，法国；7 蛋白质组学分析中心，基因组科学和生物技术研究生院，巴西利亚天主教大学，巴西利亚-DF 71966-900，巴西；8 S-Inova Biotech，Dom Bosco 天主教大学，Campo Grande-MS 79117-900，巴西）
方案 使用 CRISPR/Cas9 在马克斯克鲁维酵母中进行无标记基因敲除和敲低的方案
人们对食品和工业酵母马克斯克鲁维酵母的菌株工程越来越感兴趣，不同的研究小组已经描述并使用了许多 CRISPR/Cas9 系统。我们开发的方法允许使用细胞的内源性 DNA 修复机制非常快速有效地灭活靶基因。我们使用的菌株和质粒是免费提供的，在这里我们提供了一套集成的方案，可以轻松灭活基因并将 DNA 片段精确整合到基因组中，例如用于启动子替换、等位基因交换或引入点突变。这些方案使用 Cas9/gRNA 表达质粒 pUCC001 和 Golden Gate 组装来对靶向序列进行分子克隆。提供了一组全基因组的靶向序列。在野生型菌株或缺乏非同源末端连接 (NHEJ) DNA 修复的菌株中使用这些质粒，第一组方案解释了如何在精确目标处引入插入/缺失（NHEJ 介导）或精确缺失（同源性依赖性修复 (HDR) 介导）。第二组方案描述了如何交换启动子或编码序列以产生重编程基因。这些方法不需要使用显性或营养缺陷型标记基因，因此产生的菌株不含标记。这些方案已在多个 K. marxianus 菌株中进行了测试，非常简单，可以在任何分子生物学实验室中进行，无需专门的设备。
配方条件对脂质纳米颗粒特性和 CRISPR RNP 基因敲除和校正功能传递的影响
摘要：CRISPR-Cas9 系统是一种新兴的治疗工具，具有纠正多种遗传疾病的潜力。然而，对于基因治疗应用，需要一种有效的运载工具，能够将 CRISPR-Cas9 成分运送到目标细胞群的细胞溶胶中。在本研究中，我们优化了脂质纳米颗粒 (LNP) 的配方条件，以运送现成的 CRISPR-Cas9 核糖核酸蛋白 (RNP)。复合过程中的缓冲液组成和相对 DOTAP 浓度因 LNP 封装内部生产的 Cas9 RNP 或 Cas9 RNP 与用于基因校正的额外模板 DNA 而不同。通过不对称流场流分馏 (AF4) 对 LNP 的尺寸、表面电荷和等离子体相互作用进行了表征。在荧光报告细胞系上对粒子进行了功能筛选，以进行基因敲除和基因校正。这揭示了 RNP 与柠檬酸盐缓冲液和 PBS 的不相容性。我们证明了用于基因敲除的 LNP 不一定需要 DOTAP，而用于基因校正的 LNP 仅在低浓度的 DOTAP 下才有效。AF4 研究还表明 LNP 与血浆相互作用，但保持稳定，而 HDR 模板似乎有利于 LNP 的稳定性。在最佳配方条件下，我们在纳摩尔浓度的 CRISPR-Cas9 RNP 下分别实现了高达 80% 和 20% 的基因敲除和基因校正效率。
使用 CRISPR/Cas9 技术敲除莱茵衣藻中的 Cia5 基因并评估对照和突变分离株中的二氧化碳封存
摘要：CRISPR/Cas9 技术是基因组编辑和靶基因突变的常用方法之一，最近已用于操纵莱茵衣藻等微藻。此外，该技术还可以通过研究遗传途径来改良藻类菌株，在对抗温室气体（例如二氧化碳）产生方面发挥作用。在藻类中，有几种对 CO 2 作出反应的基因和控制每种基因表达的调节剂；Cia5 是最关键的转录调节剂之一。在本研究中，我们使用 CRISPR/Cas9 技术敲除 Cia5 基因，并分析了莱茵衣藻进行 CO 2 封存的能力。我们的结果表明，在 0.5% CO 2 浓度下，莱茵衣藻在对照和突变体物种中的表现（即对 CO 2 处理的响应）均优于其他浓度。然而，对照微藻种群和突变种群之间的差异在于 CO 2 去除效率。此外，我们的研究结果显示，对照型分离物在 CO 2 浓度为 0.04%、0.5% 和 1% 时去除效率分别为 27%、37% 和 21%。然而，对于相同浓度的突变种群，观察到的去除效率分别为 16%、23% 和 9%。
通过碱基编辑环化外显子的反向剪接位点敲除环状RNA
引言与连接上游 5′ 剪接位点 (ss) 和下游 3′ ss 的经典剪接不同，反向剪接将下游 5′ 反向剪接位点 (bss) 与上游 3′ bss 连接，产生共价闭合的环状 RNA (circRNA) [1-7]。尽管反向剪接的加工方式不利，但它由与经典剪接相同的剪接体机制催化 [8-10]，表明它们之间存在直接竞争 [11]。此外，反向剪接也受顺式元件和反式因子的严格调控 [10,12-16]，导致 circRNA 在所检测的广泛细胞系、组织和物种中呈现时空表达 [17-25]。越来越多的证据表明，circRNA 表达失调与人类疾病有关，如癌症 [ 26 – 29 ]、系统性红斑狼疮 [ 30 ] 和神经元变性 [ 31 , 32 ]，表明它们在生理和病理条件下都发挥着潜在作用 [ 1 , 2 , 5 ]。从机制上讲，大多数 circRNA 位于细胞质中，有些被发现充当 miRNA 或蛋白质的诱饵 [ 12 , 15 , 19 , 22 , 30 , 32 , 33 ]。尽管如此，大多数 circRNA 的生物学意义仍未被充分探索，部分原因是其功能研究方法有限，例如 DNA 水平上的 circRNA 敲除 (KO)。例如，CRISPR/Cas9 基因组编辑去除了
腺嘌呤碱基编辑介导的外显子跳跃在培养猪细胞中诱导基因敲除
在存在原间隔区相邻基序 (PAM) 序列的情况下，ABE 可用于将猪基因组中特定位置的 A·T 转换为 G·C，从而模拟单碱基突变引起的遗传疾病（Anzalone 等人，2020 年；Porto 等人，2020 年）。然而，基因敲除需要将起始密码子 ATG 转换为 GTG（或将 ATG 转换为
BAd-CRISPR：在成年小鼠肩胛间棕色脂肪组织中诱导基因敲除
CRISPR/Cas9 已实现多种组织中的可诱导基因敲除；然而，尚未有其在棕色脂肪组织 (BAT) 中的应用报道。在此，我们开发了棕色脂肪细胞 CRISPR (BAd-CRISPR) 方法来快速检测一个或多个基因的功能。使用 BAd-CRISPR，将表达单向导 RNA (sgRNA) 的腺相关病毒 (AAV8) 直接施用于在棕色脂肪细胞中表达 Cas9 的小鼠的 BAT。我们表明，将 AAV8-sgRNA 局部施用于成年小鼠的肩胛间 BAT 可强有力地转导棕色脂肪细胞，并使脂联素、脂肪甘油三酯脂肪酶、脂肪酸合酶、周脂素 1 或硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1 的表达降低 90% 以上。施用多个 AAV8 sgRNA 可同时敲除多达三个基因。 BAd-CRISPR 诱导移码突变并抑制靶基因 mRNA 表达，但不会导致 BAT 中脱靶突变的大量积累。我们利用 BAd-CRISPR 创建了可诱导的解偶联蛋白 1 (Ucp1) 敲除小鼠，以评估 UCP1 缺失对成年小鼠适应性产热的影响。可诱导的 Ucp1 敲除不会改变核心体温；然而，BAd-CRISPR Ucp1 小鼠的成纤维细胞生长因子 21 循环浓度升高，并且 BAT 基因表达发生变化，与通过增加过氧化物酶体脂质氧化而产生的热量一致。其他分子适应性预示着额外的细胞效率低下，蛋白质合成和周转增加，线粒体对线粒体编码基因表达的依赖降低，核编码线粒体基因表达增加。这些数据表明 BAd-CRISPR 是一种加速脂肪组织生物学发现的有效工具。