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World File Search System疟原虫
临床上无症状的间日疟原虫感染。......
50 毫升毛细血管血样（n = 295）在现场保存在液氮中，随后储存在 -20°C 下，用于在自动化 QIASymphony 平台（Qiagen）上使用 QIAsymphony DNA Investigator 试剂盒（德国希尔登 Qiagen）提取寄生虫 DNA。最终 DNA 洗脱体积为 100 µL。使用基于 SYBR Green 的属特异性定量 PCR 进行疟疾分子筛查。引物对（PCBF，5'-ATG CTT TAT TAT GGA TTG GAT GTC-3' 和 PCBR，5'-CAG ACC GTA AGG TTA TAA TTA TGT-3'）靶向人类感染疟原虫的细胞色素b（cytb）基因的保守序列（21），检测阈值为每微升 0.2 个扩增子拷贝（相当于每毫升约 4 个疟原虫，假设每个单核血液阶段疟原虫平均有 50 个线粒体基因组拷贝）。20 微升反应体系含有 5 微升 DNA 溶液、7.5 微升
瞄准蚊子体内的疟原虫 - Pure
概念验证研究表明，用于人类治疗的抗疟药物也可用于蚊子，以阻断疟疾传播。部署新的控制工具最好在管理计划内进行，该计划通过最大限度地降低抗药性进化的风险并减缓其一旦出现就传播的速度来最大限度地延长药物的使用寿命。我们要问：针对蚊子体内的寄生虫会产生什么流行病学和进化后果？我们的综合研究表明，针对蚊子体内的寄生虫 (i) 可以通过轻松扩展现有的流行病学框架来建模；(ii) 提供了一种功能新颖的控制方法，与针对人类寄生虫相比，它对抗药性进化的抵抗力更强；(iii) 可以延长专门用于治疗人类的抗疟药的寿命和临床效益。
工具包用于支持针对目标的药物发现恶性疟原虫赖氨酸TRNA合成酶
摘要：迫切需要新药物来预防和治疗疟疾。大多数抗疟药发现依赖于表型筛查。但是，随着改进的目标验证策略的发展，现在正在利用以目标为中心的方法。在这里，我们描述了工具包的开发，以支持有希望的靶靶标，赖氨酸TRNA合成酶（PF KRS）的治疗性开发。该工具包包括抗性突变体，以探测抗性机制和针对特定化学型的靶向参与；一种能够产生适合配体浸泡的晶体的杂种KRS蛋白，从而提供高分辨率的结构信息以指导化合物优化；化学探针促进旨在揭示各种特定相互作用蛋白质和热蛋白质组谱分析（TPP）（TPP）的下拉研究；以及简化的等温TPP方法，可在生物学相关的环境中无公正地确认靶向靶向。这种工具和方法的组合充当开发未来目标软件包的模板。关键字：疟原虫，赖氨酸TRNA合成酶，热蛋白质组分析（TPP），等温TPP，化学下拉，抗疟药
对遗传上不同的恶性疟原虫菌株进行条形码编码，以比较评估其适应性和抗疟药物耐药性
摘要 恶性疟原虫对抗疟药物（包括目前最前沿的抗疟药物青蒿素）的耐药性不断出现，是疟疾控制的一个长期问题。下一代测序大大加速了耐药性相关基因多态性的鉴定，但也凸显了需要更灵敏、更准确的实验室工具来分析现在和未来的抗疟药物，并量化耐药性获得对寄生虫适应度的影响。适应度和药物反应之间的相互作用对于理解为什么特定的遗传背景更能推动自然种群中耐药性的进化至关重要，但寄生虫适应度状况对耐药性流行病学的影响通常很难在实验室中准确量化，因为检测的准确性和通量有限。这里我们提出了一种可扩展的方法来分析基因上不同的恶性疟原虫菌株的适应度和药物反应，这些菌株对几种抗疟药的敏感性有很好的描述。我们利用 CRISPR/Cas9 基因组编辑和条形码测序来追踪整合到非必需基因 (pfrh3) 中的独特条形码。我们在三种具有不同地理来源的菌株的多重竞争性生长测定中验证了这种方法。此外，我们证明这种方法可以成为一种追踪青蒿素反应的有力方法，因为它可以在多种寄生虫系混合物中识别出青蒿素抗性菌株，这表明了一种在条形码寄生虫系文库中扩展费力的环状阶段存活率测定的方法。总的来说，我们提出了一种新颖的高通量方法，用于多重竞争性生长测定来评估寄生虫的适应度和药物反应。
疟原虫激酶组的更新和阐明
疟疾是一种由疟原虫引起的热带疾病，通过受感染的按蚊叮咬传播。蛋白激酶 (PK) 在疟疾病原体的生命周期中起着关键作用，使这些蛋白质成为抗疟药物研发活动的有吸引力的靶标。作为了解寄生虫信号传导功能的努力的一部分，我们报告了对八种疟原虫 PK 的生物信息学流程分析的结果。到目前为止，还没有进行过 P. malariae 和 P. ovale 激酶组组装。我们对预测的激酶进行了分类、整理和注释，以更新迄今为止发表的 P. falciparum、P. vivax、P. yoelii、P. berghei、P. chabaudi 和 P. knowlesi 激酶组，并首次报告了 P. malariae 和 P. ovale 的激酶组。总体而言，在所有疟原虫属激酶组中鉴定出 76 至 97 种 PK。大多数激酶被分配到九个主要激酶组中的七个：AGC、CAMK、CMGC、CK1、STE、TKL、OTHER；以及疟原虫特异性组 FIKK。约 30% 的激酶已深入分类为组、科和亚科级别，只有约 10% 仍未分类。此外，更新和比较间日疟原虫和恶性疟原虫的激酶组可以优先选择激酶作为潜在的药物靶标，可用于探索发现抗疟新药。通过这种综合方法，我们选出了 37 种蛋白激酶作为潜在靶点，并鉴定出对无性疟原虫 (3D7 和 Dd2 菌株) 阶段具有中等体外活性的试验化合物，这些化合物可作为未来寻找有效抗疟药物的起点。2022 年由 Elsevier BV 代表计算和结构生物技术研究网络出版。这是一篇根据 CC BY-NC-ND 许可协议开放获取的文章 ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ )。
用于恶性疟原虫基因功能研究的无泄漏诱导型 CRISPRi/a 系统
摘要 通过将催化失活的 Cas9 (dCas9) 与组蛋白脱乙酰酶 (Sir2a) 或乙酰转移酶 (GCN5) 的活性域融合，该 CRISPR 干扰/激活 (CRISPRi/a) 系统允许在转录水平上进行基因调控，而不会导致寄生虫基因组发生永久性变化。然而，dCas9 的组成性表达对研究必需基因构成了挑战，这可能会导致寄生虫的适应性变化，掩盖真正的表型。在这里，我们开发了一种无泄漏诱导型 CRISPRi/a 系统，通过整合 DiCre/loxP 调节子，允许在雷帕霉素瞬时诱导下表达 dCas9-GCN5/-Sir2a，这允许通过引入针对其转录起始区的向导 RNA 来方便地转录调控感兴趣的基因。利用在无性红细胞发育过程中处于沉默状态或从低水平到高水平表达的八种基因，我们评估了该系统在无性寄生虫中的稳健性和多功能性。对于大多数分析的基因，这种可诱导的 CRISPRi/a 系统导致目标基因在 mRNA 水平上上调或下调 1.5 到 3 倍。PfK13 和 PfMYST 表达的改变导致对青蒿素的敏感性改变。对于自噬相关蛋白 18（与青蒿素抗性相关的必需基因），通过可诱导的 CRISPRi/a 获得了 0.2 倍的上调或下调，导致生长迟缓。对于配子发生的主要调节器 PfAP2-G，通过 CRISPRa 获得了 0.10 倍的 PfAP2-G 转录本增加，导致。诱导寄生虫的配子体血症高出 4 倍。此外，可诱导的 CRISPRi/a 还可以调节配子体中的基因表达。这种可诱导的表观遗传调控系统为研究恶性疟原虫的基因功能提供了一种快速方法。
CRISPR/Cas9 和疟原虫的基因筛选
引起疟疾的疟原虫每个基因组约 30 Mb，编码约 5000 个基因，但大多数基因的功能仍不清楚。这是因为从序列同源性中获取的功能注释很少，而且与许多模型生物相比，其遗传可处理性较低。近年来，技术突破使得在疟原虫中进行正向和反向基因组规模筛选成为可能。此外，成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 9 (CRISPR/Cas9) 技术的应用大大提高了单基因水平的基因编辑效率。在这里，我们回顾了疟原虫基因筛选的出现，以分析寄生虫基因在基因组规模上的功能及其对理解寄生虫生物学的影响。 CRISPR/Cas9 筛选彻底改变了人类和模型生物的研究，但由于需要更复杂的 CRISPR/Cas9 基因靶向载体库，因此尚未在疟疾寄生虫中实施。因此，我们向读者介绍了相关顶复门弓形虫中基于 CRISPR 的筛选，并讨论了如何调整这些方法来开发基于 CRISPR/Cas9 的疟疾寄生虫基因组规模遗传筛选。此外，由于超过一半的疟原虫基因是正常无性血液阶段繁殖所必需的，并且无法使用敲除方法进行靶向，我们讨论了如何使用 CRISPR/Cas9 来扩大条件基因敲除方法，以系统地为必需基因分配功能。
在蚊子身上使用抗疟药可以克服按蚊和疟原虫对疟疾控制策略的抵抗力
按蚊对杀虫剂的抗药性和疟原虫对药物的抗药性的蔓延导致全球疟疾死灰复燃，因此开发能够克服这些障碍的控制工具成为当务之急。我们最近的研究表明，当冈比亚按蚊雌性接触到处理过的表面上的抗疟药时，可以有效阻断恶性疟原虫的传播，而不会对蚊子适应性的主要成分产生负面影响。在这里，我们证明这种方法可以克服蚊子对杀虫剂的抗药性和疟原虫对药物的抗药性的障碍。我们表明，当来自田间、对杀虫剂有抗药性的按蚊接触到强效的细胞色素b抑制剂阿托伐醌时，针对蚊子的抗疟药的传播阻断效果得以保持，表明这种药物可以逃避可能干扰其功能的杀虫剂抗药性机制。此外，这种方法还可以防止来自田间、对青蒿素有抗药性的疟原虫的传播。恶性疟原虫（Kelch13 C580Y 突变体）的抗药性，证明该策略可用于防止诱导对一线抗疟药产生抗性的寄生虫突变的传播。当蚊子将阿托伐醌摄入糖溶液中时，包括在持续感染中，阿托伐醌在限制寄生虫发育方面也非常有效。这些数据支持使用针对蚊子的抗疟药作为补充和扩大当前疟疾控制干预措施有效性的有希望的工具。
发现具有 II 型强效恶性疟原虫蛋白激酶 6 (PfPK6) 抑制剂
摘要 疟疾是一种毁灭性疾病，导致全球发病率和死亡率显著上升。青蒿素类联合疗法是治疗疟疾的一线疗法，但随着这种疗法的耐药性不断上升，开发具有新作用机制的替代抗疟药的必要性也日益凸显。抑制疟原虫蛋白激酶为药物开发提供了一个尚未得到充分探索的机会。PfPK6 已被确定为恶性疟原虫无性血液阶段增殖的必需激酶，但尚未开展药物化学研究以开发抑制剂。在这项研究中，我们报告了利用分裂荧光素酶三杂交技术，使用 KinaseSeeker 检测法确定 Ki8751 是一种 PfPK6 抑制剂（IC 50 = 14 nM）。设计、合成了一系列 79 种 Ki8751 的 1-苯基-3-(4-(喹啉-4-基氧)苯基)脲衍生物，并评估了它们对 PfPK6 的抑制作用和抗疟原虫活性。通过基团效率分析，我们确定了支架上关键基团对抑制 PfPK6 的重要性，这与 II 型抑制剂药效团一致。我们重点介绍了有助于抗疟原虫活性的尾部基团修饰。我们报告了化合物 67 的发现，它是一种有效的 PfPK6 抑制剂（IC 50 = 13 nM），对恶性疟原虫血液阶段（EC 50 = 160 nM）有效，化合物 79 是一种优秀的 PfPK6 抑制剂（IC 50 < 5 nM），对恶性疟原虫血液阶段（EC 50 = 39 nM）和伯氏疟原虫肝脏阶段（EC 50 = 220 nM）具有双阶段抗疟活性。这些结果为将该化学型进一步开发为新型抗疟药和针对 PfPK6 的化学探针奠定了基础，从而可以进一步研究 PfPK6 的功能。