a. 95% 乙醇(Sigma E7023 或同等溶液) b. 不含 DNase/RNase 的水(Life Technologies AM9937 或同等溶液) c. 去离子水/蒸馏水/Milli-Q 水 d. NaCl(Sigma S3014 或同等溶液) e. NaOH(Sigma S5881 或同等溶液) f. HCl(Sigma H1758 或同等溶液) g. 甘氨酸(Sigma G7126 或同等溶液) h. 10X PBS 组织培养 (tc) 级(Sigma P5493)稀释至 1X i. KCl(Sigma P9541 或同等溶液) j. 磷酸二氢钾(Sigma P9791 或同等溶液) k. 磷酸氢二钠(Sigma S5011 或同等溶液) l. 甘油(Sigma G5516 或同等溶液) m.无 DNase/RNase 微量离心管,不粘连、低吸附、硅化 0.5 ml(Life Technologies AM12350 或同等产品) n. 无 DNase/RNase 微量离心管 1.5 ml,不粘连、低吸附、硅化(Life Technologies AM12450 或同等产品) o. 无 DNase/RNase 微量离心管 2.0 ml,不粘连、低吸附、硅化(Life Technologies AM12475 或同等产品) p. 过滤屏障防气溶胶微量移液器吸头,无 DNase/RNase(0.2 – 1000 µl) q. Qiagen QIAamp 病毒 RNA 小量试剂盒(Qiagen 52904) r. Qiagen 收集管(Qiagen 19201) s. OneStep™ PCR 抑制剂去除试剂盒(Zymo Research D6030) t. 2.0 mL 微量离心管,不含 DNase/RNase(USA Scientific 1620-2799 或同等产品) u. OneStep RT-PCR 试剂盒(Qiagen 210210 或 210212) v. Ambion Superase·In RNase 抑制剂(20 单位/µl);Life Technologies AM2694 (2,500 U) 或 AM2696 (10,000 U) w. Eppendorf DNA LoBind Tubes 5.0 mL Fisher Scientific 0030108310 或同等产品 x. 15 ml 聚丙烯锥形管(Fisher Scientific 14-959-70C 或同等产品) y. 50 mM MgCl 2(BioRad 1708872 或同等产品)或 25 mM MgCl 2(ThermoFisher Scientific AB0359 或同等产品)z.内部对照 RNA(BioGX 目录号 750-0001 - 联系公司)aa. 所有 RTqPCR 检测的标准脱盐引物和 HPLC 探针(Integrated DNA Technologies 或同等公司)bb. RT-qPCR 阳性对照(甲型流感病毒的定量基因组 RNA
1。简短离心管,包含siRNA,以确保在管子的底部收集siRNA颗粒。2。使用表1。a中列出的所需量的所需的最终浓度重悬于无RNase 1X siRNA缓冲液中(请参见下面的注释)。例如:对于10 nmol的siRNA和20 µm库存浓度,加入500 µl 1x siRNA缓冲液。3。移液器上下溶液上下3-5次,避免引入气泡并牢固密封管(或多孔板)。4。在室温下将溶液放在轨道搅拌机/振动器上30分钟。5。简短离心管,包含siRNA,以确保将溶液收集在管子底部。6。使用260 nm处的紫外分光光度法验证siRNA的浓度。对于siRNA,1 µm = 13.3 ng/µl。对于microRNA模拟,1 µm = 14.1 ng/µl和microRNA发夹抑制剂,1 µm = 18.5 ng/µl请参阅FAQ,有关其他信息。7。RNA可以立即使用,或将等分等分为较小的体积以限制冻融周期的数量。重悬于的siRNA应将其存储在-20°C中,以手动除霜或非周期冰柜。在4°C下存储最多可容纳6周。
15. 将 Matrigel 包被的培养板和 hiPSC 培养基预热至 20-25 C。16. 从预包被的培养板中吸出 Matrigel 并加入 hiPSC 培养基(6 孔板每孔 2 ml)。17. 将 9 ml hiPSC 培养基加入到 15 ml 离心管中。18. 将低温小瓶直接转移到 37 C 水浴中并观察解冻过程。当管中大部分内容物解冻并仅剩下一小块冰时,迅速取出并用 70% 乙醇彻底清洗。19. 小心地将细胞逐滴转移到准备好的带有培养基的 15 ml 离心管中。以 200 3 g 的速度离心 5 分钟。20. 小心吸出上清液。将沉淀物悬浮在 hiPSC 培养基(例如 1 ml)中,并接种到准备好的 Matrigel 包被的培养板上。前 24 小时加入 1 ml/ml 2 mM Thiazovivin(最终浓度 2 m M)。21. 如果 24 小时后细胞附着良好,则用 hiPSC 培养基更换培养基。如果附着力较低,再加入 1 ml/ml 2 mM Thiazovivin(最终浓度 2 m M),培养 24 小时。从第二天开始,每天更换培养基,每孔(6 孔)加入 2 ml hiPSC 培养基。继续“hiPSC 传代和维护”,步骤 1-8。
将 20 μl 蛋白酶 K 溶液(20 mg/ml,提供)加入到 1.5 ml 微量离心管(未提供)底部。向管中转移 200 μl 样品。向管中加入 200 μl Buffer JBL。涡旋管以彻底混合。在 56 °C 下孵育 10 分钟。短暂旋转以去除盖子内部的任何水滴。向样品中加入 200 μl 冷却的无水乙醇(未提供),涡旋 30 秒以彻底混合样品,然后短暂旋转以去除盖子内部的任何水滴。将混合物小心地转移到 G 型柱(迷你)中,以 13,000 rpm 离心 1 分钟,弃去通过液,将迷你柱重新插入收集管中。
纳米素是一个新型的磁盘,上面覆盖了高密度的微型和纳米结构二氧化硅,可用于快速提取和纯化高质量的DNA和RNA。高表面积和独特的结合机制使其具有非凡的结合能力,可以在微离心管格式中隔离高纯度,高分子量(HMW)DNA。它使用标准的液化,绑定,洗涤和洗脱程序,对于二氧化硅DNA提取技术是常见的。每个管中使用一个磁盘。但是,与磁珠和二氧化硅自旋柱不同,这些磁珠剪切了大DNA,纳米蛋白磁盘结合并释放了DNA而不破碎的DNA,以将DNA长到巨囊中。
材料和步骤 微量离心管 20g/l CTAB 研钵和研杵 1.4M NaCl 离心机 0.1M Tris-HCl pH 计 20mM Na2EDTA 称重天平 dH2O 移液器吸头 硼酸 刮铲 Tris 碱 称量皿/纸 EDTA 移液器 DNA 大小标准(Ladder DNA) 烧杯-烧瓶 样品(生菜叶) 6x 凝胶上样缓冲液 琼脂糖 溴化乙锭(0.5 ug /ml) 1X TBE 缓冲液 A. 制备 0.5 M EDTA 原液(500 ml) 称量 93.05 g EDTA 并将其溶解在 200 ml dH 2 O 中,同时用磁力搅拌。用 NaOH 将 pH 值调节至 8.4。用 dH 2 O 将体积调节至 500 ml。
将色谱柱放入干净的微量离心管中。将30-50µL洗脱缓冲液,TE缓冲液或无菌水直接加到柱膜上,并站立2分钟。对于大于8KB的DNA片段,在65°C -70°C下使用预热的洗脱缓冲液,以提高洗脱效率。在10,000 x g处离心1分钟以洗脱DNA。将DNA存储在4°C或-20°C下。对于较高的产率,在50µL中洗脱DNA,为更高的浓度,以较小体积的DNA(即:30µL)洗脱DNA。但是,产量将略有降低。确保洗脱缓冲液直接分配到膜的中心,以完全洗脱。te缓冲液也可以洗脱DNA。如果用水用于洗脱DNA,则最大洗脱效率在PH7.0和8.5之间。将DNA存储在-20°C时,DNA可能在没有缓冲剂的情况下会降解。
•DNA大小 - 能够恢复基因组和线粒体DNA尺寸片段˃50kb。如果存在,也将回收寄生,微生物和病毒DNA。•DNA产量 - 色谱柱的DNA结合能力为125 µg。通常,哺乳动物组织产生:每毫克骨骼,心脏,肺和脑组织1-3 µg DNA,每毫克肝脏和肾脏3-5 µg DNA。人类全血将产生3-7 µg DNA,每100 µL取样。•洗脱体积 - DNA可以洗脱至200 µL DNA洗脱缓冲液或水。•设备 - 水浴或热块(55°C),离心机或真空源和歧管,微离心,涡流,圆锥管(15 - 50 mL)和微量离心管。•DNA应用 - 使用Quick -DNA™MidiPrep Plus套件分离的DNA可用于生命科学研究(例如下一代SEQ。),基因分型,牲畜育种,兽医研究和常规应用测试。
1。使用砂浆和杵用液氮将粉末磨粉样品磨成细粉。有关样本中断的详细信息,请参阅第5页。2。将多达25毫克的组织粉转移到新的1.5 ml微量离心管中。注意:对于具有较高细胞数量(例如肝脏或脾脏)的组织样品,将样品输入降低至10 mg。 3。加入200 µL GL1缓冲液和20 µL蛋白酶K溶液。涡流混合。4。将样品在60°C孵育3小时/过夜。偶尔将管子倒转。5。在14,000 x g处离心2分钟,到颗粒不溶性碎片。6。将上清液转移到新的1.5 mL微输出管中。7。加入200 µL GL2缓冲液。涡流混合。8。添加4 µL RNase A溶液。涡旋在室温下混合并孵育5分钟。
从Lipografter®系统中表征脂肪酸的脂肪酸盐过量的脂肪酸盐被置于无菌50ml离心管中,并运送到MTF生物制剂以进行表征。在1倍磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤脂肪酸2-3次,直到组织颜色为淡黄色。添加了涉及0.1%胶原酶型IA溶液(Sigma-Aldrich Inc.,GA)的修改隔离方案2后,添加了一个修改的隔离方案2,并在37ºC的水浴中孵育2小时(在搅拌下)。消化后,组织显得光滑,胶原酶消化被相等的维护培养基灭活,由DMEM/F12,10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉菌素/链霉菌素(Fisher Scientific,PA)组成。然后将溶液离心以收集SVF颗粒。然后将SVF颗粒重悬于氯化铵溶液中,并在室温下孵育10分钟,以帮助裂解红细胞。最后,将溶液离心以隔离