注意 本产品仅供研究使用。它不适用于人类或动物的治疗或诊断程序。此外,请勿将本产品用作食品、化妆品或家居用品等。未经 Takara Bio Inc. 书面批准,不得转售或转让、修改以进行转售或转让或用于制造商业产品。如果您需要其他用途的许可,请通过我们的网站 www.takarabio.com 与我们联系。您对本产品的使用还需遵守产品网页上描述的任何适用许可要求。您有责任查看、理解并遵守此类声明所施加的任何限制。所有商标均为其各自所有者的财产。某些商标可能并未在所有司法管辖区注册。
请注意,此产品仅用于研究用途。它不打算用于人类或动物的治疗或诊断程序。另外,请勿将此产品用作食品,化妆品或家居用品等。takara产品不得转售或转让,修改用于转售或转让,或无需未经Takara Bio Inc.的书面批准而用于制造商业产品。如果您需要其他使用许可证,请通过我们的网站www.takarabio.com与我们联系。您对此产品的使用也符合产品网页上所述的任何适用许可要求。您有责任审查,理解并遵守此类陈述所施加的任何限制。所有商标都是其各自所有者的财产。某些商标可能不会在所有司法管辖区注册。
Pfu DNA 聚合酶是一种源自超嗜热古菌 Pyrococcus furiosus 的耐热酶,因其高保真度和强大的加工性而广受认可。它的 3'-5' 核酸外切酶活性使其成为正确扩增短链和复杂 DNA 链不可或缺的酶。Pfu DNA 聚合酶的这些生化特性促进了其提取和生产方法的重大进步。本综述涵盖了一些传统的纯化方法,包括蛋白质纯化和亲和层析,以及重组基因表达、自动化生产系统和基于膜的技术的最新进展。最近开发了新的酶工程方法,例如 CRISPR-Cas9 介导的基因优化,这提高了提取效率的标准以满足新兴需求。曾经具有挑战性的 Pfu DNA 聚合酶生产已通过在实验室和商业规模的大肠杆菌中重组表达得到了显着简化。涉及 IPTG 浓度和响应面方法的优化技术已将产量提高了 30%。自诱导意味着可以实现更高的生物量输出。如今,Pfu DNA 聚合酶的应用范围从标准 PCR 到分子生物学、法医分析、临床微生物学和生物技术领域的高级临床诊断。
注意:主混合物应在指定的“洁净室”区域制备,并且切勿将提取液/模板带入“洁净室”。主混合物制备完成后,在制备主混合物的洁净罩中,或在打开 DNA/RNA 模板(脏)罩中的 DNA 模板(提取的样本)之前,向每个 PCR 反应管中添加 20 或 45 或 90μl 主混合物。
注意 本产品仅供研究使用。它不适用于人类或动物的治疗或诊断程序。此外,请勿将本产品用作食品、化妆品或家居用品等。未经 Takara Bio Inc. 书面批准,不得转售或转让、修改以进行转售或转让或用于制造商业产品。如果您需要其他用途的许可,请通过我们的网站 www.takarabio.com 与我们联系。您对本产品的使用还需遵守产品网页上描述的任何适用许可要求。您有责任查看、理解并遵守此类声明所施加的任何限制。所有商标均为其各自所有者的财产。某些商标可能并未在所有司法管辖区注册。
序列 MLPKRRRARVGSPSGDAASSTPPSTRFPGVAIYLVEPRMGRSRRAFLTGLAR SKGFRVLDACSSEATHVVMEETSAEEAVSWQERRMAAAPPGCTPPALLDISW LTESLGAGQPVPVECRHRLEVAGPRKGPLSPAWMPAYACQRPTPLTHHNTGL SEALEILAEAAGFEGSEGRLLTFCRAASVLKALPSPVTTLSQLQGLPHFGEHSS RVVQELLEHGVCEEVERVRRSERYQTMKLFTQIFGVGVKTADRWYREGLRTL DDLREQPQKLTQQQKAGLQHHQDLSTPVLRSDVDALQQVVEEAVGQALPGA TVTLTGGFRRGKLQGHDVDFLITHPKEGQEAGLLPRVMCRLQDQGLILYHQH QHSCCESPTRLAQQSHMDAFERSFCIFRLPQPPGAAVGGSTRPCPSWKAVR VDLVVAPVSQFPFALLGWTGSKLFQRELRRFSRKEKGLWLNSHGLFDPEQKT FFQAASEEDIFRHLGLEYLPPEQRNA
Cenarchaeum symbiosum DNA 聚合酶 II 大亚基 (polC) 是古菌 Cenarchaeum symbiosum 中 DNA 复制过程中的关键酶。其主要功能包括在细胞分裂和基因组维持过程中合成 DNA 链。其研究领域包括揭示其在基因组稳定性中的作用以及探索其在研究古细菌遗传学中的应用。在分子生物学和古细菌遗传学中,polC 是理解 DNA 复制机制的关键焦点。该酶的重要性在于提供对基本生物过程的洞察,促进古细菌分子生物学的进步。
1. 美洲大学(UDLA)研究总局研究实验室,安提瓜 Vía a Nayón S/N,基多 EC 170124,厄瓜多尔; 2. 美洲大学(UDLA)工程与应用科学学院生物技术工程项目,安提瓜 Vía a Nayón S/N,基多 EC 170124,厄瓜多尔; 3. 厄瓜多尔基多美洲大学(UDLA)健康科学学院兽医学项目,Antigua Vía a Nayón S/N,基多 EC 170124,厄瓜多尔; 4. 农业产业与环境科学学院。农业生涯。卡尔奇州立理工大学 (UPEC)。 Antisana S/N 和 University Avenue,图尔坎 EC 040102,厄瓜多尔; 5. 罗萨里奥国立大学(UNR)兽医学院。奥维迪奥拉各斯大道和 33 号公路卡西尔达 – 圣达菲 – 阿根廷; 6. 厄瓜多尔中央大学兽医学与畜牧学院,厄瓜多尔基多,Gatto Sobral 和 Jerónimo Leiton,基多 EC 170521,厄瓜多尔; 7. 美洲大学(UDLA)教学兽医诊所,Shuara 街 N40-55 和 De Los Granados 大道,基多,EC 170503,厄瓜多尔; 8. 美洲大学(UDLA)“一个健康研究小组”,安提瓜 Via a Nayón S/N,基多 EC 170124,厄瓜多尔。通讯作者:Luis Nuñez,电子邮件:fabiann7@yahoo.es 共同作者:ALG:a.abel.loor.giler@gmail.com,SCR:sara.castillo.reyes@udla.edu.ec,SSP:silvanahsp@yahoo.com,MC:rolando.campos@upec.edu.ec,RMP:rpmena@uce.edu.ec,SPC:sdpch2021@gmail.com 收稿日期:2024 年 5 月 8 日,接受日期:2024 年 9 月 11 日,在线发表日期:2024 年 10 月 17 日
图1。三个小聚合酶核酶基序的发现和进化。(a)选择构造的格式用于初始选择回合(回合1至3或1至5),库是通过柔性链接器链接到杂交标签的六聚体标签的。生物素化引物可以捕获活性连接酶(在图中进行了详细描述S1-S2)。(b)在后期回合中使用的选择构建体的格式(3至11或5至11),需要三磷酸化的三核苷酸(Triplet)底物的聚合。在选择过程中,三胞胎(xxx)的序列(xxx)和由模板(x'x'x')编码的三重态数(y)在选择过程中变化(表S1中的详细信息)。(c)序列和预测从显示迭代三重三重连接的库中发现的三个核酶的二级结构,即三重酶聚合酶活性。在绿色中,源自随机库部分的核苷酸。在灰色的核苷酸中,源自恒定区域(接头和引物结合位点)。(d)在(b)中显示的(c)中显示的核酶的迭代三重聚会聚合,带有xxx = gcg和x'x'x'= cgc,y = 3。反应条件:50 nm核酶 - 基底,50 nm引物BCY3P10GA,50 nm模板T6FP10GAGCG3,5μMPPPGCG三胞胎,0.05%Tween 20,200 mm Kcl,50 mm Kcl,50 mm mgcl 2,50 mm mgcl 2,50 mm ches-koh,ph 9,3天,3天,以-77°°°°°°°°核酶与模板杂交。(E)序列和预测源自1-40克隆的QT51核酶的二级结构。黑色圆圈表示从1-40个祖先序列突变的6个残基;三角形表示2-核苷酸缺失。(f)60核苷酸序列的合成,该序列由CGU三重态的20个重复组成。Reaction conditions: 0.25 μM primer F10, 0.25 μM template tP10CGU20, 0.25 μM ribozyme, 10 μM pppCGU triplet, QT51 in 0.05% Tween 20, 50 mM MgCl 2 , 50 mM CHES-KOH, pH 9, 5TU+t1.5 in 200 mM MgCl 2 , 50 mM Tris-Cl, pH 8.3, 2 weeks在-7°C冷冻。核酶未与模板杂交。
DNA 复制和转录同时发生在同一 DNA 模板上,导致复制体和 RNA 聚合酶之间不可避免地发生冲突。这些冲突会阻碍复制叉并威胁基因组稳定性。尽管许多研究表明正面冲突比同向冲突更有害,也更容易促进 R 环形成,但 RNA 聚合酶障碍极性的根本原因仍不清楚,这些 R 环的结构也只是推测。在这项工作中,我们使用一个简单的模型系统来解决这个复杂的问题,通过检查 Pol II 障碍到通过机械解压缩前进的 DNA 叉来模拟复制体的进展。我们发现,即使转录本大小最小,Pol II 也能更稳定地结合以抵抗正面配置中的移除,这表明 Pol II 障碍具有固有的极性。然而,具有长 RNA 转录本的延长 Pol II 在保留极性的同时成为更强大和持久的障碍,而 RNA-DNA 杂交的形成介导了这种增强。令人惊讶的是,我们发现当 Pol II 与 DNA 叉正面碰撞并回溯时,RNA-DNA 杂合体会在 Pol II 前方的滞后链上形成,形成拓扑锁,将 Pol II 困在叉上。TFIIS 通过切断 Pol II 与杂合体的连接来促进 RNA-DNA 杂合体的去除。我们进一步证明,当 Pol II 仍与 DNA 结合时,这种 RNA-DNA 杂合体可以通过 T7 DNA 聚合酶引发滞后链复制。我们的研究结果捕捉到了 Pol II 与 DNA 叉相互作用的基本特性,揭示了转录-复制冲突的重要意义。