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World File Search SystemAgrobacterium
ld-肽对农杆菌的适应性和极性生长至关重要
肽聚糖（PG）是一种网状结构，是细菌细胞壁的主要成分，对于维持细胞完整性和形状至关重要。大多数细菌依靠青霉素结合蛋白（PBP）进行交联，但某些物种也采用LD-转肽酶（LDTS）。与PBP不同，LDT的本质和生物学功能在很大程度上不清楚。以其极性生长而闻名的字母细菌的杂种菌序，其PG异常富含LD-Crosslinks，这表明LDT在这些细菌中可能在PG合成中起更重要的作用。在这里，我们研究了植物病原体农杆菌tumefaciens中的LDT，发现该细菌中至少有14个假定的LDT中的14种引起的LD-肽对其存活至关重要。值得注意的是，缺乏独特的7个LDT的突变体在杂种菌中广泛保守的突变体表现出降低的LD互动和PG将PG束缚到外膜β-贝尔β-桶蛋白上的链接。因此，这种突变体遭受了严重的健身损失和细胞形状的圆形，强调了这些菌粒特异性LDT在维持细胞壁完整性和促进延伸方面所起的关键作用。tn-sequering屏幕表现出了a的非冗余功能。Tumefaciens LDTS。具体而言，连字符特异性LDTs与除法和细胞周期蛋白表现出合成的遗传相互作用，而来自另一组的单个LDT。此外，我们的发现表明，缺乏所有LDT的菌株表现出独特的表型特征和遗传相互作用。总体而言，我们的工作强调了ld-rosslinking在a中的关键作用。tume-faciens细胞壁完整性和生长，并为这些交联活动的功能专业化提供了见解。
从芽型农业菌株中利用发育基因进行利他转化
• LEC 1, 2 – LEAFY COTYLEDON • EBB1 - EARLY BUD BREAK 1 (ESR family) • BBM – BABY BOOM • WOX 5, 11 -- WUSCHEL RELATED HOMEOBOX • IPT – ISOPENTYL TRANSFERASE (cytokinin) – Agrobacterium • Agrobacterium oncogenes • ROL – Hairy root-inducing genes – Agrobacterium • WUS – WUSCHEL • GRF-GIF - 生长调节因子4和GRF相互作用因子1
社论：农杆菌介导的果树作物转化的新进展，第二卷
三十多年来，农杆菌介导的转化技术一直用于树果作物的基因工程。尽管在草本植物和一年生植物的水平上利用这项技术仍然存在许多障碍，但该领域已经取得了很大进展（Song 等人，2019 年）。在本研究主题的第二卷中，有论文描述了不同研究小组正在采取的方法，以促进难处理的树种的遗传转化，并在更基本的层面上了解 T-DNA 插入宿主细胞基因组的机制。在一项优雅的研究中，Gelvin 等人研究了 T 环的形成作为理解 T-DNA 整合的代理。在这项工作中，从转基因植物本氏烟或拟南芥中形成的 T 环中详细描述了与 LB-RB 连接相关的区域。结果表明，T 环中的 RB-LB 连接类似于 T-DNA 和发生整合的植物 DNA 之间的连接。相似之处包括：与 RB 相比，LB 处的缺失频率更高且序列变化更为广泛；连接位点存在微同源性；存在来自农杆菌或植物基因组的填充 DNA；多个 T-DNA 拷贝的多联体组织，其中 RB-RB 和 LB-LB 连接比 RB-LB 连接更常见。此外，作者还表明，T 环的形成即使在农杆菌 VirD2 基因中没有 Ku80 和 w 突变的情况下也能进行，其影响与对 T-DNA 整合的影响相似。根据他们的数据，作者提出 T 环的形成可用于研究 T-DNA 整合到宿主基因组的所有方面。大多数关于柑橘转化的已发表研究都仅使用了少数相对容易转化的品种的材料（Song 等人，2021 年）。 TAMU 的 Mandadi 团队（Dominguez 等人）开发了一种方法，可以促进 14 种柑橘品种的转化。他们通过在转化方案中使用的培养基中添加亚精胺和硫辛酸等补充剂，并使用含有额外 VirG 和 VirE 基因拷贝的辅助质粒 pCH32 来实现这一点。
通过农杆菌感染瞬时 TALEN 表达对四倍体马铃薯进行靶向基因组编辑
摘要 使用位点特异性核酸酶（例如转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和成簇的规律间隔短回文重复序列-CRISPR 相关蛋白 9 (CRISPR-Cas9)）进行基因组编辑是一种强大的作物育种技术。对于植物基因组编辑，基因组编辑试剂通常在植物细胞中从基因组内稳定整合的转基因中表达。这需要杂交过程从基因组中去除外来核苷酸以产生无效分离子。然而，在马铃薯等高度杂合的植物中，子代品系与亲本品种具有不同的农艺性状，不一定成为优良品系。农杆菌可以将 T-DNA 上的外源基因转移到植物细胞中。这既可用于稳定转化植物，也可用于在植物细胞中瞬时表达基因。在这里，我们用含有靶向固醇侧链还原酶 2 ( SSR2 ) 基因的 TALEN 表达载体的农杆菌感染马铃薯，并在没有选择的情况下再生了芽。我们获得了具有破坏的 SSR2 基因且没有转基因 TALEN 基因的再生系，这表明它们的破坏应该是由瞬时基因表达引起的。这里开发的使用农杆菌瞬时基因表达的策略（我们称之为农杆菌诱变）应该会加速使用基因组编辑技术来修改杂合植物基因组。
使用机器学习技术
启动子是基因上游的那些基因组区域，这些区域受RNA聚合酶的启动基因转录绑定。因为它是基因表达的最关键要素，因此启动子的识别对于理解基因表达的调节至关重要。这项研究旨在开发基于机器学习的模型，以预测tumefaciens（A. tumefaciens）菌株C58中的启动子。在模型中，启动子序列由三种不同类型的特征描述符编码，即累积的核苷酸频率，k-mer核苷酸组成和二进制编码。使用相关和基于MRMR的算法优化了所获得的特征。这些优化的特征被输入到一个随机森林（RF）分类中，以区分A. tumefaciens菌株C58中的非促进序列的启动子序列。对10倍交叉验证的检查表明，所提出的模型可以产生0.837的整体精度。该模型将为A. tumefaciens C58菌株中启动子的研究提供帮助。
花青素辅助农杆菌浸润用于快速评估多种植物物种的基因组编辑效率
摘要：基于 CRISPR 的基因组编辑技术继续推动生命科学的重大进步。实现基因组编辑在植物和农业中的广泛应用的主要挑战是建立能够使用瞬态方法快速、全面和精确地评估编辑技术的方法。在这里，我们报告了一种使用农杆菌浸润技术的新型快速基因组编辑评估方法，可以对基因组编辑效率进行广谱、简单和精确的评估。我们使用花青素标记来促进基因组编辑细胞的视觉筛选，以用于成年草莓果实以及番茄果实、棉花叶和甜菜叶。使用这种方法，我们展示了快速测量 SpCas9、LbCas12a、A3A-PBE、ABE8e 和 PPE 介导的基因组编辑效率的能力。这种新方法将使研究人员能够快速轻松地评估广泛植物物种的基因组编辑工具，从而进一步加快基因组编辑农作物的开发。
农杆菌和单个 Cas9-sgRNA 转录系统介导的多年生黑麦草高效基因编辑
基因组编辑技术为多年生黑麦草（一种全球重要的牧草和草坪草种）的遗传改良提供了强有力的工具。关于多年生黑麦草基因编辑的唯一出版物使用基因枪进行植物转化，并使用基于双启动子的 CRISPR/Cas9 系统进行编辑。然而，它们的编辑效率很低（5.9% 或只产生了一株基因编辑植物）。为了测试玉米泛素 1 (ZmUbi1) 启动子在多年生黑麦草基因编辑中的适用性，我们制作了 ZmUbi1 启动子：RUBY 转基因植物。我们观察到 ZmUbi1 启动子在芽再生之前的愈伤组织中活跃，这表明该启动子适用于多年生黑麦草中的 Cas9 和 sgRNA 表达，以高效生产双等位基因突变植物。然后，我们使用 ZmUbi1 启动子来控制多年生黑麦草中的 Cas9 和 sgRNA 表达。Cas9 和 sgRNA 序列之间的核酶切割靶位点允许在转录后产生功能性 Cas9 mRNA 和 sgRNA。使用农杆菌进行遗传转化，我们观察到在多年生黑麦草中编辑 PHYTOENE DESATURASE 基因的效率为 29%。DNA 测序分析表明，大多数 pds 植物含有双等位基因突变。这些结果表明，由 ZmUbi1 启动子控制的单个 Cas9 和 sgRNA 转录单元的表达为产生多年生黑麦草的双等位基因突变体提供了一种高效的系统，并且也适用于其他相关草种。
花青素辅助农杆菌浸润用于快速评估多种植物物种的基因组编辑效率
摘要：基于 CRISPR 的基因组编辑技术继续推动生命科学的重大进步。实现基因组编辑在植物和农业中广泛应用的主要挑战是建立能够使用瞬态方法快速、全面和精确评估编辑技术的方法。在这里，我们报告了一种使用农杆菌浸润技术的新型快速基因组编辑评估方法，可以对基因组编辑效率进行广谱、简单和精确的评估。我们采用了花青素标记物来促进对基因组编辑细胞的视觉筛选，以用于成年草莓果实以及番茄果实、棉花叶和甜菜叶。使用这种方法，我们展示了快速测量由 SpCas9、LbCas12a、A3A-PBE、ABE8e 和 PPE 介导的基因组编辑效率的能力。这种新方法将使研究人员能够快速轻松地评估广泛植物物种的基因组编辑工具，从而进一步加快基因组编辑农作物的开发。
通过农杆菌介导的基因转移获得的编辑植物的分子表征综合方法
摘要 农杆菌介导的基因转移——实际上是基因改造植物最常用的方法——可能导致植物基因组中整合多个 T-DNA 拷贝，以及形成由改造细胞和野生型细胞组成的嵌合组织。因此，对转化株系进行分子表征是一种很好的做法，可以选出最好的株系进行进一步研究。如今，有几种定量和半定量技术可用于估计转基因植物中 T-DNA 的拷贝数 (CN)。在本研究中，我们比较了基于 (1) 实时聚合酶链式反应 (qPCR)、(2) 液滴数字 PCR (ddPCR) 和 (3) 下一代测序 (NGS) 的三种方法，对葡萄编辑株系进行分子表征。这些株系含有通过 CRISPR/Cas9 技术获得的敲除突变，该突变与植物对两种重要的葡萄霉菌病的易感性有关。根据我们的结果，qPCR 和 ddPCR 的输出在准确性方面基本一致，尤其是对于低 CN 值，而 ddPCR 的结果比 qPCR 更精确。关于 NGS 分析，用这种方法检测到的 CN 通常与 qPCR 和 ddPCR 计算的 CN 不一致，并且 NGS 无法区分十个品系中的三个的整合点。尽管如此，NGS 方法可以肯定地识别 T-DNA 截断或串联/倒置重复的存在，从而提供有关转基因整合资产的独特和相关信息。此外，Cas9 和单向导 RNA (sgRNA) 的表达分析以及靶位点的测序增加了与 CN 数据相关的新信息。这项工作通过报告葡萄编辑品系的实际案例研究，探讨了最先进的诊断技术在早期选择合适的转基因材料方面的优缺点。结果可能对开发新转基因品系的科学家和负责转基因控制的实验室都感兴趣。
改进的农杆菌介导的转化和再生方案，用于成功进行茄子基因工程和基因组编辑
成功的基因操作很大程度上取决于有效的转化和再生方法。农杆菌介导的转化一直是通过基因工程和最近开发的基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑方法改良作物的首选方法。在本研究中，我们为三个高产茄子品种 BARI begin 2、4 和 6 开发了一种改进的再生和农杆菌介导的转化方案。深入研究了几个关键参数，包括培养基组成、生长调节剂浓度、兼容抗生素选择、超水和生根过程。对于研究中使用的三种不同外植体，发现 MS + 2.5 mg/l BAP 单独作为激素补充剂是实现最大芽再生的最佳选择。当在 MS + BAP 2.5 mg/l 补充培养基中分别以 0.2 mg/l 和 0.1 mg/l 的浓度使用酪蛋白水解物和山梨糖醇时，观察到超水显著降低（16.67 ± 0.11%）。发现当农杆菌浓度为 0.6（OD 600 nm）、感染 10 分钟、共培养 2 天时，转化效率最高。我们发现 100 mg/l 浓度的卡那霉素适合作为筛选茄子转化事件的选择压力。此方案中标准化的生根培养基成分在体外和体外条件下均提供了更高的生根率（85%）。使用此方案，可以轻松克服茄子基因工程中存在的问题，并提高转化效率。