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Joel Hague -Curriculum Vitae
随后，海牙先生在Albert Kausch博士的实验室开始了研究生研究，在那里他利用农杆菌的转基因植物研究获得了各种各样的经验，这些经验利用了稻米，草皮，草皮，开关和玉米的介导的和生物学转化系统。海牙先生的硕士论文的重点是对从基因ZM13分离的玉米花粉特异性启动子进行分析，并利用转基因水稻携带的启动子与GUSA报告基因融合在一起。他在分子遗传分析方面的实验室工作利用了各种技术，包括DNA提取，凝胶电泳和PCR分析，以及许多分子克隆标准的技术。他完成了高级微生物学，微生物遗传学，生物化学，植物分子生物学，植物生物技术的课程工作，并在2009年成功捍卫了他的论文并获得了硕士学位。分子遗传学。
基因组编辑引起的植物的未知可能性 - 零发射
1）Abe F.等。（2019）基因组编辑的三重衰退突变改变了小麦的种子休眠状态。细胞报告28，1362-1369。2）Cong L.等。（2013）使用CRISPR/CAS9系统的多重基因组工程。科学339，819-823。3）Ito Y.等。（2017）RIN突变的重新进化和RIN在诱导番茄成熟诱导中的作用。自然工厂3，866-874。4）Jinek M.等。（2012）适应性细菌免疫中可编程的双RNA引导的DNA核酸内切酶。科学337，816-821。5）Jinek M.等。（2013）人类细胞中的RNA编程基因组编辑。Elife 2，E00471。6）Mali P.等。（2013）通过CAS9通过RNA引导的人类基因组工程。科学339，823-826。7）Yasumoto S.等。（2020）通过农业感染通过短暂的talen表达在四倍体马铃薯中靶向基因组编辑。植物生物技术37，205-211。
一种用于拟南芥基因组中 T-DNA 插入片段高通量定位的接头连接介导 PCR 方法
农杆菌转移 DNA (T-DNA) 是一种有效的植物诱变剂，已用于在拟南芥中创建序列索引的 T-DNA 插入系，作为研究基因功能的工具。创建 T-DNA 插入系需要一种可靠的方法来定位基因组中的插入位点。在本方案中，我们描述了一种接头连接介导的 PCR 方法，我们已使用该方法筛选突变体文库并识别了超过 150,000 个 T-DNA 插入突变体；该方法还可用于绘制单个突变体的图谱。该过程包括三个步骤：限制性酶介导的接头与基因组 DNA 的连接；使用针对接头和 T-DNA 的特异性引物对 T-DNA/基因组 DNA 连接处进行 PCR 扩增；对 T-DNA/基因组连接处进行测序以便绘制到参考基因组。在大多数情况下，测序的基因组区域延伸到 T-DNA 边界，从而可以识别插入物的准确位置。整个过程需要2周时间才能完成。
在植物转化，再生和基因...
图1：旨在评估P ESR1驱动基因158激活的基因构建体的实验验证。烟草芽片段用159个农杆菌（GV3101）转化，其中包含cmylcv :: ruby（a）和p在esr1 :: ruby 160（b）显示有限或没有愈伤组织形成。虽然35s :: AtWind1 - 161 AteSr1 :: Ruby（c）的共表达显示出更大的愈伤组织形成和ATESR1 162启动子的激活。（d）愈伤组织形成的定量分析，如区域所示（MM 2）。Explants 163用CAMV 35S :: AtWind1转换出来，显示出大约3-4倍的愈伤组织形成。164（e）在ATESR1启动子下方的IPT等发育调节基因及其165通过ATWIND1激活的表达诱导了快速的愈伤组织诱导，并形成了芽根尖分生组织，166个导致了phytohormone-fime Hormone培养基中的De从头寄生虫的诱导。167
木制物种中的转换系统（B. rapa，...
农杆菌介导的转化是一种将外源基因转化为植物的广泛使用的方法。烟草（Nicotiana tabacum L.）是遗传转化中的模型植物。下面描述了将烟草用作模型植物的几个原因如下：（1）烟草叶片很容易被器官发生再生（Constantin等，1977）。（2）当植物需要从实验室转移到温室状况时，烟草植物很容易采用环境的变化（Chandra等，2010； Jube＆Borthakur，2007）。良好采用环境会提高再生率。（3）烟草植物的生物量产量很高，因此可以轻松生产重组蛋白来用于分子种植（Twyman等，2003）。如今，烟草的分子遗传学和基因组图进行了充分的研究，几乎完成了（Jube＆Borthakur，2007）。烟草中遗传转化的研究和应用为其他植物的转化系统提供了前景和参考。
在植物转化，再生和基因...
图1：旨在评估P ESR1驱动基因158激活的基因构建体的实验验证。烟草芽片段用159个农杆菌（GV3101）转化，其中包含cmylcv :: ruby（a）和p在esr1 :: ruby 160（b）显示有限或没有愈伤组织形成。虽然35s :: AtWind1 - 161 AteSr1 :: Ruby（c）的共表达显示出更大的愈伤组织形成和ATESR1 162启动子的激活。（d）愈伤组织形成的定量分析，如区域所示（MM 2）。Explants 163用CAMV 35S :: AtWind1转换出来，显示出大约3-4倍的愈伤组织形成。164（e）在ATESR1启动子下方的IPT等发育调节基因及其165通过ATWIND1激活的表达诱导了快速的愈伤组织诱导，并形成了芽根尖分生组织，166个导致了phytohormone-fime Hormone培养基中的De从头寄生虫的诱导。167
研究分子生物学家（研究助理），GS- ...
薪资范围：$ 82,764.00- $ 107,590.00每年USDA，农业研究服务，外国疾病科学研究部门位于马里兰州弗雷德里克堡的外国疾病科学研究部，正在寻求一名两年任命的博士后研究员。最近的博士学位（在过去的四年内）需要分子生物学，植物科学或相关学科。此机会仅适用于美国公民和合法的永久居民。参与者将以GS-11，步骤1的薪水（$ 82,764.00）加上福利输入。现任人的主要研究目标是使用农业和/或生物学转化方法开发和优化侵入性杂草常见坦西（Tanacetum vulgare）的遗传转化方案。次要目标涉及生物信息学和靶向基因敲除。需要了解植物转化方案，生物信息学，遗传转化/选择以及一般分子生物学技术。有关更多信息和/或兴趣，请给Matthew Tancos博士发送电子邮件（matthew.tancos@usda.gov）。USDA-ARS是机会均等的机会提供者和雇主。
蓖麻植物中的 CRISPR/Cas9 介导基因组编辑......
摘要 动机：CRISPR/Cas9 技术已被开发为最有效和最广泛使用的基因组编辑工具，用于修改众多植物的基因组，其中双链 DNA 中的 cas9 切割由单个向导 RNA（sgRNA）中包含的 20 个核苷酸序列驱动。然而，使用 CRISPR/Cas9 同时编辑多个目标仍然是该领域的技术挑战（Ma 等人，2014 年）。方法：在本研究中，使用 Golden Gate Assembly 克隆策略生成多个 CRISPR/cas9 编辑结构以用于蓖麻植物。模块化克隆系统使用 IIS 型酶在其识别位点外切割，从而允许有效组装具有兼容突出端的 DNA 片段，从而同时促进多个序列的正确取向（Engler 等人，2014 年）。我们的主要目标是获得一种遗传构建体，允许在同一个质粒载体中表达两个 sgRNA 和 cas9 核酸酶，以便通过农杆菌感染转化蓖麻。选择了两个针对 FAH12 蓖麻羟化酶的 CRISPR 靶标以避免可能的脱靶。这些靶标包含在 sgRNA 中并克隆到 0 级质粒中，每个质粒两侧都有 BsaI 酶的限制位点。Golden Gate 1 级反应包括几个 BsaI 消化和连接循环，将 U6 启动子与两个 sgRNA 分别组装到 1 级质粒中，两侧都有 BpiI 限制位点。同时，cas9 酶在双强 35S 启动子的控制下克隆，随后是来自 0 级质粒的胭脂碱合酶 (nosT) 终止子，包括这些元素，克隆到另一个 1 级质粒中，两侧也有 BpiI 限制位点。然后，用 BpiI 消化所有 1 级元件（U6-sgRNA1、U6-sgRNA2、2x35S-cas9-nosT）时，会出现兼容的突出端，这些突出端可以以正确的顺序和方向组装成 2 级结构。最终结果是 2 级质粒，其中包括 FAH12 羟化酶的 CRISPR/cas9 多重基因组编辑所需的所有元件。该构建体将转移到农杆菌中，以便以后进行蓖麻胚转化。
2021-2022 STEM 可持续发展案例大赛
血浆病毒血症。CRISPR 和 LASER ART 协同作用将有效靶向储存位点并完全切断宿主的 HIV-1 前病毒 DNA。此外，CRISPR-Cas9 将用于从宿主基因组中切除 HIV-1 前病毒 DNA，使用 AAV9 进行递送并消除潜伏的 HIV-1 前病毒。小鼠将通过移植人类 CD34+ HSC 进行人源化并通过流式细胞术确认。研究中将使用四组 HIV 感染大鼠：CRISPR-Cas9 治疗组、LASER ART 治疗组、联合治疗组和对照组。联合疗法在啮齿动物试验中已证明在去除潜伏感染性储存器方面取得了一定程度的成功。通过体内切除 HIV-1 亚基因组 DNA 片段来去除整合的前病毒 DNA；接受联合疗法治疗的大鼠没有潜伏的 HIV-1 储存器。相反，仅用 LASER ART 或 CRISPR-Cas9 治疗的啮齿动物组没有消除 HIV-1 的证据。这一证据为进一步研究和进行非人类灵长类动物试验以开发治疗方法的可能性奠定了基础。使用 BLAST 通过宏基因组分析研究海星消耗病的病因 Samantha McGuinness，BSc NEUR [1]，Kathryn Austin，BSc MFB [2]，Emily Gibbons，BSc MBG [3] [1] 圭尔夫大学心理学系，加拿大安大略省圭尔夫 N1G 2W1 [2] 圭尔夫大学综合生物学系，加拿大安大略省圭尔夫 N1G 2W1 [3] 圭尔夫大学分子和细胞生物学系，加拿大安大略省圭尔夫 N1G 2W1 海星消耗病 (SSW) 是一种影响全球小行星的疾病。最严重的是，2013 年，东北太平洋超过 20 种物种大规模死亡。 SSW 的病因不明，但有 3 种理论：病毒感染、微生物作用于有机物 (OM) 导致动物与水界面的 O 2 耗尽，或两者结合形成一种综合症。本研究将通过确定来自含有 OM 诱发的萎缩性 Pisaster ochraceus 的水箱的水是否会在采用不同 OM 处理的水箱中诱发 P. ochraceus 的 SSW，来调查 SSW 是否是一种综合症。受影响水箱的水将通过管道输送到另外两个水箱中，这两个水箱中都有未感染的 P. ochraceus。这三个水箱被分为一个水箱中有受 OM 诱发的受影响 P. ochraceus，一个水箱中有灭菌 OM，一个水箱中没有 OM。将测量 SSW 的发病情况，并使用生物信息学技术 BLAST 在组织和水柱中检测先前确定的微生物的存在和组成。预计没有 OM 的水箱中 SSW 的发生率会较低，因为这种条件下病毒可以存活，而微生物则无法存活。该研究可以评估 SSW 是否是病毒病原体和微生物作用相互作用的结果。在评估每个水箱的致病性和微生物生长水平后，在未来研究中，可以进一步分析显示可见星病数量最多的水箱。由于 SSW 的病因仍然未知，评估病毒和微生物的关系和重要性对于找到可能的解决方案至关重要。尽管证据支持许多潜在的致病因素，但很少有研究研究 SSW 中病毒和微生物之间可能存在的相互作用。利用 CRISPR-Cas9 系统和农杆菌进行外壳蛋白研究，帮助作物产生双生病毒抗性 Kajisha Vijayakumar，食品学学士 [1]，Iman Andrea Niyokindi shima，公共卫生学学士 [2] [1] 圭尔夫大学食品科学系，加拿大安大略省圭尔夫 N1G 2W1 [2] 圭尔夫大学物理系，加拿大安大略省圭尔夫 N1G 2W1 双生病毒已经给印度豆类和非洲木薯产业造成了数百万美元的损失，并引发全球粮食短缺。双生病毒是具有小基因组和少量编码蛋白质的 DNA 病毒。近年来，人们研究了成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)，试图开发出作物对这些病毒的抗性。Cas9（一种位点特异性 DNA 内切酶）和合成的单向导 RNA (sgRNA) 构成了 CRISPR-Cas9 机制。Cas9 通过 sgRNA 定向到其基因组靶区域，并通过两个核酸酶域切割噬菌体。Cas9-切口酶提高了切割准确性并允许更大的缺失。根据文献，CRISPR 可用于删除植物易感性 (S) 基因，以产生作物的抗病性。然而，尚未发现双生病毒的特定 S 基因。一个建议的解决方案是针对外壳蛋白 AV1/V1，这是双生病毒的唯一结构蛋白。这些蛋白质对其功能至关重要，因为它们负责病毒 DNA 往返于细胞核，并与 ssDNA 结合以实现有效复制。我们假设 CRISPR-Cas9 可以与 Cas9-nickases（以提高功效）和农杆菌一起递送到受影响的作物中。农杆菌是一种在植物细胞中产生肿瘤的病原体，但由于其具有转移 DNA 的能力，也用于转基因。农杆菌插入 T-DNA 的预期效果是外壳蛋白发生突变，这将损害外壳蛋白并使其失活。如果没有这种结构蛋白，病毒感染就不会有效，使双生病毒变得毫无用处。这将使农业受益，防止数十亿作物受到感染，从而提高生产力并减少全球粮食危机。很少有研究分析过 SSW 中病毒和微生物之间可能存在的相互作用。利用 CRISPR-Cas9 系统和农杆菌改造外壳蛋白，帮助作物产生双生病毒抗性 Kajisha Vijayakumar，食品学学士 [1]，Iman Andrea Niyokindi shima，公共卫生学学士 [2] [1] 圭尔夫大学食品科学系，加拿大安大略省圭尔夫 N1G 2W1 [2] 圭尔夫大学物理系，加拿大安大略省圭尔夫 N1G 2W1 双生病毒给印度豆类和非洲木薯产业造成了数百万美元的损失，并引发全球粮食短缺。双生病毒是一种基因组较小、编码蛋白质较少的 DNA 病毒。近年来，人们研究了成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)，试图让作物产生对这些病毒的抗性。 Cas9（位点特异性 DNA 内切酶）和合成的单向导 RNA（sgRNA）构成 CRISPR-Cas9 机制。Cas9 通过 sgRNA 定向到其基因组靶区域，并通过两个核酸酶域切割噬菌体。Cas9-切口酶可提高切割准确性并允许更大的缺失。根据文献，CRISPR 可用于删除植物易感性 (S) 基因，从而在作物中产生抗病性。然而，尚未发现双生病毒的特定 S 基因。建议的解决方案是针对外壳蛋白 AV1/V1，这是双生病毒的唯一结构蛋白。这些蛋白质对其功能至关重要，因为它们负责病毒 DNA 往返于细胞核，并结合 ssDNA 以实现有效复制。我们假设 CRISPR-Cas9 可以与 Cas9-切口酶（以提高功效）和农杆菌一起递送到受影响的作物中。农杆菌是一种在植物细胞中产生肿瘤的病原体，但由于其具有转移 DNA 的能力，因此也可用于转基因。农杆菌插入 T-DNA 的预期效果是外壳蛋白发生突变，这将破坏外壳蛋白并使其失活。如果没有这种结构蛋白，病毒感染就不会有效，从而使双生病毒变得毫无用处。这将使农业受益，防止数十亿农作物受到感染，从而提高生产力并减少全球粮食危机。很少有研究分析过 SSW 中病毒和微生物之间可能存在的相互作用。利用 CRISPR-Cas9 系统和农杆菌改造外壳蛋白，帮助作物产生双生病毒抗性 Kajisha Vijayakumar，食品学学士 [1]，Iman Andrea Niyokindi shima，公共卫生学学士 [2] [1] 圭尔夫大学食品科学系，加拿大安大略省圭尔夫 N1G 2W1 [2] 圭尔夫大学物理系，加拿大安大略省圭尔夫 N1G 2W1 双生病毒给印度豆类和非洲木薯产业造成了数百万美元的损失，并引发全球粮食短缺。双生病毒是一种基因组较小、编码蛋白质较少的 DNA 病毒。近年来，人们研究了成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)，试图让作物产生对这些病毒的抗性。 Cas9（位点特异性 DNA 内切酶）和合成的单向导 RNA（sgRNA）构成 CRISPR-Cas9 机制。Cas9 通过 sgRNA 定向到其基因组靶区域，并通过两个核酸酶域切割噬菌体。Cas9-切口酶可提高切割准确性并允许更大的缺失。根据文献，CRISPR 可用于删除植物易感性 (S) 基因，从而在作物中产生抗病性。然而，尚未发现双生病毒的特定 S 基因。建议的解决方案是针对外壳蛋白 AV1/V1，这是双生病毒的唯一结构蛋白。这些蛋白质对其功能至关重要，因为它们负责病毒 DNA 往返于细胞核，并结合 ssDNA 以实现有效复制。我们假设 CRISPR-Cas9 可以与 Cas9-切口酶（以提高功效）和农杆菌一起递送到受影响的作物中。农杆菌是一种在植物细胞中产生肿瘤的病原体，但由于其具有转移 DNA 的能力，因此也可用于转基因。农杆菌插入 T-DNA 的预期效果是外壳蛋白发生突变，这将破坏外壳蛋白并使其失活。如果没有这种结构蛋白，病毒感染就不会有效，从而使双生病毒变得毫无用处。这将使农业受益，防止数十亿农作物受到感染，从而提高生产力并减少全球粮食危机。成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 已被研究，以尝试开发作物对这些病毒的抗性。Cas9（位点特异性 DNA 内切酶）和合成的单向导 RNA (sgRNA) 构成 CRISPR-Cas9 机制。Cas9 通过 sgRNA 定向到其基因组靶区域，并通过两个核酸酶域切割噬菌体。Cas9-切口酶提高了切割准确性并允许更大的缺失。根据文献，CRISPR 可用于删除植物易感性 (S) 基因，以产生作物的抗病性。然而，尚未发现双生病毒的特定 S 基因。建议的解决方案是针对外壳蛋白 AV1/V1，这是双生病毒的唯一结构蛋白。这些蛋白质对其功能至关重要，因为它们负责病毒 DNA 往返于细胞核，并结合 ssDNA 以进行有效复制。我们假设 CRISPR-Cas9 可以与 Cas9-nickases（以提高功效）和农杆菌一起递送到受影响的作物中。农杆菌是一种在植物细胞中产生肿瘤的病原体，但由于其具有转移 DNA 的能力，也用于转基因。农杆菌插入 T-DNA 的预期效果是外壳蛋白发生突变，这将损害外壳蛋白并使其失活。如果没有这种结构蛋白，病毒感染就不会有效，使双生病毒变得毫无用处。这将使农业受益，防止数十亿作物受到感染，从而提高生产力并减少全球粮食危机。成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 已被研究，以尝试开发作物对这些病毒的抗性。Cas9（位点特异性 DNA 内切酶）和合成的单向导 RNA (sgRNA) 构成 CRISPR-Cas9 机制。Cas9 通过 sgRNA 定向到其基因组靶区域，并通过两个核酸酶域切割噬菌体。Cas9-切口酶提高了切割准确性并允许更大的缺失。根据文献，CRISPR 可用于删除植物易感性 (S) 基因，以产生作物的抗病性。然而，尚未发现双生病毒的特定 S 基因。建议的解决方案是针对外壳蛋白 AV1/V1，这是双生病毒的唯一结构蛋白。这些蛋白质对其功能至关重要，因为它们负责病毒 DNA 往返于细胞核，并结合 ssDNA 以进行有效复制。我们假设 CRISPR-Cas9 可以与 Cas9-nickases（以提高功效）和农杆菌一起递送到受影响的作物中。农杆菌是一种在植物细胞中产生肿瘤的病原体，但由于其具有转移 DNA 的能力，也用于转基因。农杆菌插入 T-DNA 的预期效果是外壳蛋白发生突变，这将损害外壳蛋白并使其失活。如果没有这种结构蛋白，病毒感染就不会有效，使双生病毒变得毫无用处。这将使农业受益，防止数十亿作物受到感染，从而提高生产力并减少全球粮食危机。病毒感染不会有效，使双生病毒变得毫无用处。这将使农业受益，防止数十亿农作物受到感染，从而提高生产力并减少全球粮食危机。病毒感染不会有效，使双生病毒变得毫无用处。这将使农业受益，防止数十亿农作物受到感染，从而提高生产力并减少全球粮食危机。
植物基因编辑不再需要组织培养
植物基因编辑可对植物进行有针对性的改造，在作物的基因功能分析和精准育种方面显示出巨大的潜力[1]。要生产基因编辑植物，需要将基因编辑试剂[2]（例如 CRISPR/Cas9 成分）递送到植物细胞中。这涉及一个漫长、昂贵且劳动密集型的组织培养步骤，而且目前仅在有限数量的植物物种中可行，这成为植物基因编辑的主要瓶颈。在最近一期的《自然生物技术》上，由 Daniel F. Voytas 领导的明尼苏达大学研究小组描述了一种生产基因编辑植物的新方法，同时避免了组织培养的需要（图 1）[3]。该方法利用了分生组织的从头诱导。分化的植物细胞通常不能分裂或产生不同类型的细胞。然而，之前的研究表明，通过异位表达特定的发育调节因子，可以诱导已经分化的细胞形成分生组织。分生组织是包含未分化干细胞（分生细胞）的植物组织，这些干细胞能够进行细胞分裂，并能产生各种组织和器官。例如，在拟南芥中，WUSCHEL ( WUS ) 基因在胚胎发生中起着关键作用，过表达 WUS 可以促进营养生长向胚胎生长的转变 [ 4 ] 。SHOOT MERISTEMLESS ( STM ) 和 WUS 的联合异位表达可激活拟南芥中的一组分生组织功能，包括细胞分裂和器官发生 [ 5 ] 。 ipt 基因位于土壤细菌农杆菌的 Ti 质粒上，该基因编码异戊烯基转移酶，这种酶在植物中诱导细胞分裂素的生物合成，从而刺激器官发生[6]。在单子叶植物中，婴儿潮基因（Bbm）和 WUS 基因的过度表达可促进体细胞形成胚胎，从而提高转化效率[7]。Voytas 研究小组假设分生组织可以在发育调节因子的帮助下诱导。为了验证这一想法，使用多种启动子以不同的组合在本氏烟植物中表达了玉米 WUS2、拟南芥 STM、农杆菌 ipt 和其他发育调节因子。农杆菌用于传递转基因，并以荧光素酶作为报告基因。形成了分生组织状结构，这些结构长成具有荧光素酶表达的转基因植物，并且发现该特性是可遗传的。然后，使用相同的方法，将针对两个测试基因的单个向导 RNA (sgRNA) 与成功组合的发育调节剂一起引入组成性表达 Cas9 的转基因本氏烟叶中。在产生的芽中，可以验证目标基因的编辑，并且发现突变会传递给下一代。随后出现了一个问题，即在土壤中生长的植物上是否也能诱导分生组织。这种方法确实在许多双子叶植物中被证明是成功的，除了本氏烟草，在马铃薯和葡萄中也是如此。此外，还产生了基因编辑的本氏烟草植物，并且发现一些编辑过的植物不含有用于编辑的转基因。从头分生组织诱导方法被称为 Fast-TrACC（快速处理的农杆菌共培养），与传统的组织培养程序相比具有明显的优势（图 1）。首先，它大大缩短了生产基因编辑植物所需的时间，从几个月缩短到几周。其次，Fast-TrACC 不需要无菌条件，并且适用于在土壤中生长的植物。组织培养方法要求使用无菌工作台和无菌培养基，因此无组织培养方法需要的资源更少，并且适用于较小的群体。第三，当 Cas9 与 sgRNA 一起递送时，在某些情况下会产生基因编辑植物