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2。设计crrna和订单指南RNA（crrna + tracrrna）...
选项2：使用Hibit印迹确认全长蛋白的表达。取编辑的细胞样品，并用首选缓冲液裂解。在凝胶上运行样品，将蛋白质转移到膜上并使用纳米-Glo®Hibit印迹系统检测。使用未经编辑的细胞作为背景的负面对照。
根据基础模型处理crrna的能力
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IDT 宣传册 4 第 1 页
Alt-R® A.s. Cas12a crRNA，2 nmol Alt-R® A.s. Cas12a crRNA，10 nmol Alt-R® L.b.Cas12a crRNA，2 nmol Alt-R® L.b.Cas12a crRNA，10 nmol Alt-R® A.s. Cas12a crRNA，2 nmol，板 Alt-R® A.s. Cas12a crRNA，10 nmol，板 Alt-R® L.b.Cas12a crRNA，10 nmol，板 Alt-R® L.b.Cas12a crRNA，2 nmol，板
具有单核苷酸的高保真DNAZYME辅助CRISPR/CAS13A系统解决特异性
有两种改善特定城市Cas12a和Cas13a核酸酶的常用方法。是工程师CRRNA，包括将合成不匹配引入crrna的间隔域，设计发夹 - 间隔者CRRNA，以及用2 0 -O -methyl修改CRRNA。21 - 25然而，必须仔细设计不匹配的CRRNA中的数量和位置，以减少无靶标的效果，而无需牺牲CAS蛋白的裂解活性。22,23更重要的是，使用发夹蛋白 - 间隔者CRRNA和2 0-O-methyl modi crrna仅将原始CRISPR/CAS系统的特定城市提高了2至3倍。24,25另一种方法是高级工程cas蛋白。26 - 28，由于复杂的蛋白质表达和筛选过程，它仍然与之合作。此外，所有这些策略旨在优化CRISPR/CAS系统的不同组成部分，而无需克服裂解效率和特定城市之间的基本交易。因此，可以显着改善特定城市的策略对于它们的实际应用（例如生物传感）非常需要，因为它们将避免误解积极的结果。dnazymes（也称为脱氧核酶，DNA酶或催化DNA），是单链DNA分子，具有
IDT_改进的 CRISPR-Cas9 HDR 方法，实现高效、高保真基因组编辑应用说明 (RUO21-0258_001 01/22)
gRNA（向导 RNA）：Cas9 使用的 CRISPR RNA（crRNA）包含 20 个碱基的原间隔元件和与 tracrRNA 互补的额外核苷酸。反式激活 CRISPR RNA（tracrRNA）与 crRNA 的互补区域杂交。组合的 crRNA 和 tracrRNA 与 Cas9 内切酶相互作用，激活编辑复合物以在目标基因组内的特定位点产生双链断裂。这 2 种天然 RNA 分子可以合成生成，用于基因组编辑实验。IDT 科学家已经修改了这些 RNA 的长度和组成，以优化基因组编辑效率，尤其是在与 CRISPR 核酸酶预先复合并以 RNP 形式递送到细胞时。或者，可以使用单向导 RNA（sgRNA）代替 crRNA 和 tracrRNA 的组合。sgRNA 包含通过发夹状环序列连接的 crRNA 和 tracrRNA 序列。向导 RNA（gRNA）可以是 crRNA：tracrRNA 复合物，也可以只是 sgRNA。
基于 CRISPR-Cas13d 的有效抗病毒策略可对抗 SARS-CoV-2
摘要：当前的 SARS-CoV-2 大流行对全球健康造成了重大负担。尽管有保护性疫苗可用，但随着新的病毒变种不断出现，人们的担忧仍然存在。基于 CRISPR 的基因编辑方法提供了一种有吸引力的治疗策略，因为 CRISPR-RNA (crRNA) 可以快速调整以适应新的病毒基因组序列。本研究旨在利用 RNA 靶向 CRISPR-Cas13d 系统攻击病毒 RNA 基因组中高度保守的序列，从而为未来其他冠状病毒的人畜共患疫情做好准备。我们设计了 29 个 crRNA，以靶向整个 SARS-CoV-2 基因组中高度保守的序列。几种 crRNA 显示出有效沉默具有匹配病毒靶序列的报告基因并有效抑制 SARS-CoV-2 复制子。抑制 SARS-CoV-2 的 crRNA 也能够抑制 SARS-CoV，从而证明了这种抗病毒策略的广度。令人惊讶的是，我们观察到，只有针对正基因组 RNA 的 crRNA 在复制子测定中表现出抗病毒活性，而那些结合负基因组 RNA（复制中间体）的 crRNA 则相反。这些结果表明 SARS-CoV-2 基因组的 +RNA 链与 − RNA 链在脆弱性和生物学方面存在重大差异，并为 RNA 靶向抗病毒药物的设计提供了重要见解。
通过选择性修饰带有 2'-氟和锁定核酸的向导 RNA 来提高 CRISPR/Cas9 系统的稳定性和特异性
摘要：利用 CRISPR/Cas 系统组件的基因组编辑方法已广泛应用于分子生物学、基础医学和基因工程。一种有前途的方法是通过修改基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑系统的组件来提高其效率和特异性。在这里，我们设计并化学合成了含有修饰核苷酸（2'-O-甲基、2'-氟、LNA — 锁定核酸）或在某些位置含有脱氧核糖核苷酸的向导 RNA（crRNA、tracrRNA 和 sgRNA）。我们比较了它们对核酸酶消化的抵抗力，并检查了由这些修饰向导 RNA 引导的 CRISPR/Cas9 系统的 DNA 切割效率。用 2'-氟修饰或 LNA 核苷酸替换核糖核苷酸增加了 crRNA 的寿命，而其他类型的修饰不会改变它们的核酸酶抗性。 crRNA 或 tracrRNA 的修饰可保持 CRISPR/Cas9 系统的有效性。否则，具有修饰 sgRNA 的 CRISPR/Cas9 系统会显著降低 DNA 切割有效性。2'-氟修饰 crRNA 的系统 DNA 切割动力学常数较高。crRNA 的 2'-修饰还可降低体外 dsDNA 切割的脱靶效应。
通过 CRISPR 进行高效、安全的基因组编辑...
摘要 CRISPR-Cas12a 系统已被开发用于在真核细胞中实现高度特异性的基因组编辑。鉴于 Cas12a 基因相对较小，该系统被认为最适用于使用 AAV 载体递送的基因治疗。之前，我们报道了富含 U 的 crRNA 能够通过 CRISPR-Cas12a 系统在真核细胞中进行高效的基因组编辑。在本研究中，我们在 crRNA 富含 U 的 3 ′-突出端的核糖 C2 处引入了甲氧基修饰。当与 Cas12a 效应蛋白混合时，核糖基-2 ′-O-甲基化 (2-OM) 富含 U 的 crRNA 能够提高 dsDNA 的消化率。此外，化学修饰的富含 U 的 crRNA 在小鼠受精卵中实现了非常安全且高度特异性的基因组编辑。工程化的 CRISPR-Cas12a 系统有望促进各种动物模型的生成。此外，工程化的 crRNA 也得到了评估，以进一步改进 CRISPR 基因组编辑工具集。
国产基因组编辑技术——CRISPR-Cas3
该服务涉及用于 CRISPR-Cas3 基因组编辑的 crRNA 的设计以及 crRNA 与 Cas 蛋白复合物的创建（用于抗病毒防御的 Cas 复合物、Cascade-crRNA 复合物）。我们共同表达组成Cascade的五种蛋白质和一种crRNA，并传递纯化的Cascade-crRNA复合物。 此外，组成 Cascade（Cas11、Cas7 和 Cas6）的蛋白质含有核定位信号 (NLS)。 该服务制备的Cascade-crRNA复合物可与Cas3蛋白NLS（编号311-09441）的切割活性结合用于CRISPR-Cas3体系。