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使用 CRISPR 干扰和扩展的 PAM 序列来调节微生物代谢率
基因组编辑 CRISPR/Cas9 技术已导致人工转录抑制因子（也称为 CRISPR 干扰 (CRISPRi)）的开发。由 crRNA 引导的失活 Cas9 (dCas9) 蛋白可以特异性地结合靶 DNA 序列，包括启动子和操纵子，而不会切割 DNA。原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列依赖性在靶向特异性 CRISPRi 的设计中可能是不利的，因为 PAM 序列对于 CRISPR/Cas9 系统的 DNA 切割至关重要。我们在 L-阿拉伯糖诱导的 P BAD 启动子的控制下，在大肠杆菌中构建了一个染色体整合的 dCas9 系统 (1 araBAD : dcas9)。将携带各种 crRNA 的质粒转化到表达 dCas9 的大肠杆菌中，这些 crRNA 具有针对 gal 启动子（-10 区域）和 gal 操纵子中的 galETK 结构基因的靶序列。在有或没有无偿 L-阿拉伯糖的情况下监测细胞生长和/或半乳糖代谢率。靶向转录延长会部分减缓 D-半乳糖消耗和细胞生长，但靶向转录起始会完全抑制 D-半乳糖消耗和细胞生长。此外，RT-qPCR 分析表明，具有几种修饰 PAM 序列的 CRISPRi 可以抑制靶 DNA 的转录。这些结果表明，可以通过使用 CRISPRi 靶向结构基因或调控区域来控制细胞代谢率和细胞生长；此外，松散的 PAM 序列依赖性可以扩展 CRISPRi 的 DNA 靶标。
2′-O-甲基修饰的向导RNA增强CRISPR-Cas12a系统的单核苷酸多态性(SNP)鉴别能力
成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白是细菌和古菌所特有的，构成了针对外来移动遗传元素的适应性免疫系统。1,2 CRISPR-Cas 系统分为第 1 类（使用多个 Cas 蛋白）和第 2 类系统（使用单个多结构域 Cas 蛋白），根据复杂性和特征蛋白又细分为六种类型（I 型至 VI 型）。3 作为第 2 类系统的成员，II-A 型 CRISPR-Cas9 得到了最广泛的研究和开发，成为基因组编辑和治疗工具。 4 Cas9 具有两个核酸酶位点——His – Asn – His (HNH) 和 RuvC 样结构域，可在双 CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 crRNA (transcrRNA) 向导介导的特定位点实现双链 DNA (dsDNA) 的精确切割。5,6
刺激响应指南的化学合成RNA用于有条件控制CRISPR-CAS9基因编辑
作为RNA通常与DNA相比具有较短的半衰期，因此这些递送方法与较低的o级效应相关。9,10，化学修改的GRNA，11 - 15，以单个指南RNA（SGRNA）11的形式或两个成分的CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRRNNA（tracrrna），请积极研究12。为了促进精确的细胞内应用，例如基因编辑和调节，通过将RNA寡核苷酸为刺激性响应性修饰阳离子配备有条件地控制GRNA活性，包括对紫外线（UV）光线（UV）Light，16 - 30 Redox条件，31,32 Redox Cresement，31,32和Bio-orthal ofthalognogalognognognogalognognognognognognognogys和Bio-orthalogansognognognognognognogansognognognognognognognogansognogys。33 - 35这些模拟阳离子可以通过核糖2 0 -OH，18,24 - 26,31,34 - 37个核碱，17,21,27 - 29和内部或末端接头引入RNA。19,20,22,23,30,33,38
一天内构建多重阵列以利用天然 CRISPR 系统
摘要 CRISPR-Cas 系统是一种原核免疫系统，不仅在细菌和古细菌中广泛增殖，而且最近在人类生物学研究和应用中也广泛存在。迄今为止，许多工作都利用了合成的 sgRNA 和 CRISPR 核酸酶 Cas9，但阵列处理核酸酶的发现现在允许在异源宿主以及具有内源系统的生物体中使用更紧凑、天然的 CRISPR 阵列。不幸的是，多重天然 CRISPR 阵列的构建在技术上仍然具有挑战性、成本高昂和/或耗时。这种限制阻碍了在天然和异源宿主中涉及天然 CRISPR 阵列的研究。为了解决这个问题，我们提出了一种组装 CRISPR 阵列的方法，这种方法简单、快速、经济实惠且高度可扩展——我们用一天的工作组装了 9 间隔阵列。我们利用这种方法来利用高能力细菌 Acinetobacter baylyi 的内源性 CRISPR 系统，结果表明虽然单个间隔区并不总是能够完全有效地阻止通过天然能力获取 DNA，但多重天然 CRISPR 阵列可以实现几乎完全的 DNA 排除和基因组编辑，包括两者的多个靶标。除了展示一种将使各种应用受益的 CRISPR 阵列组装方法之外，我们还发现了一种潜在的对冲策略，用于平衡 CRISPR 防御与天然能力的 A. baylyi 中的 DNA 获取。CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）-Cas 系统是一种适应性免疫机制，通常通过检测和切割确定的靶序列 1 来保护细菌和古菌免受核酸入侵。CRISPR 系统包括 Cas（CRISPR 相关）蛋白，以及与同样短的 DNA 间隔区交替的同名短直接重复序列阵列。间隔序列被转录成较长的前体crRNA，然后前体crRNA被加工成单个crRNA（CRISPR RNA），每个crRNA由与特定核酸靶标互补的单个间隔序列以及通常源自重复序列的发夹柄组成。这些crRNA与Cas效应蛋白（如Cas9）或蛋白质复合物（如CASCADE）结合。一旦结合，它们就会根据系统引导效应子到互补的DNA或RNA上，效应子通常会切割这些DNA或RNA。很快，许多实验室就将CRISPR介导的DNA切割应用于从精确的基因组工程到基因回路2到靶向的细菌菌株去除3-6等各种应用。自扩散的CRISPR构建体也被用于快速产生纯合二倍体敲除（诱变链式反应）7，初步研究表明
拟南芥中 CRISPR/LbCas12a 介导的基因编辑的优化
CRISPR/LbCas12a系统（LbCpf1）被广泛应用于包括植物物种在内的基因组改造，但CRISPR/LbCas12a在不同植物物种和组织中的效率差异较大，编辑效率有待进一步提高。本研究通过优化crRNA表达策略和Pol II启动子，尝试提高CRISPR/LbCas12a在拟南芥中的编辑效率。值得注意的是，CRISPR/LbCas12a系统中tRNA-crRNA融合策略与RPS5A启动子的组合具有最高的编辑效率，而EC1f-in(crR)p驱动的CRISPR/LbCas12a的纯合突变体和双等位基因突变体比例最高。此外，所有纯合突变体和双等位基因突变体都可以稳定遗传到下一代，没有发生表型分离。本研究通过筛选出拟南芥中LbCas12a的最佳crRNA表达策略和启动子，提高了CRISPR/LbCas12a系统的编辑效率，为其他植物中CRISPR/LbCas12a方法的优化提供借鉴。
CRISPR/Cpf1 系统的兴起，助力植物高效基因组编辑
Cpf1 是 2 类 CRISPR 家族的内切酶，它填补了 TALEN、ZFN 和 CRISPR/Cas9 等基因组工程工具领域之前面临的空白。其他同时发现的核酸酶无法在同一区域进行重新工程，因为首次工程后会丢失靶位点。Cpf1 充当双核酸酶，既可作为内切核糖核酸酶处理 crRNA，又可作为内切脱氧核糖核酸酶切割靶序列并产生双链断裂。此外，Cpf1 允许多重基因组编辑，因为单个 crRNA 阵列转录本可以靶向基因组中的多个基因座。CRISPR/Cpf1 系统可在单子叶植物和双子叶植物中进行基因删除、插入、碱基编辑和基因座标记，且脱靶效应更少。该工具已在烟草、水稻、大豆、小麦等作物中得到有效验证。本综述介绍了Cpf1介导的基因组编辑技术在植物中的开发和应用。
使用 CRISPR 试剂对人类 B 细胞系进行电穿孔
图 1. 最佳条件基于细胞存活率和靶向敲除率。根据上述方案，每次电穿孔用含有靶向人 CD19 的 crRNA 的 RNP（从针对不同 B 细胞系中细胞内和细胞外标志物的 30 多种 crRNA 筛选中选择）转染 100 万个 Ramos 细胞。（A）电穿孔后的第二天，用 2.5 μg/mL 碘化丙啶（BioLegend，产品目录号 421301）对部分细胞染色，并通过流式细胞术进行分析。（B）电穿孔五天后，用 2.5 μg/mL Alexa Fluor ® 647 抗人 CD19（BioLegend，产品目录号 302220，克隆 HIB19）加碘化丙啶对部分细胞染色，并通过流式细胞术进行分析。对照 = 未经电穿孔的细胞：RNP 混合物。数据由德国弗莱堡大学的 Marco Cavallari 博士提供。
在 CRISPR-Cas12a 中，α-螺旋盖引导目标 DNA 进行催化
CRISPR-Cas12a 是一种强大的 RNA 引导基因组编辑系统，它利用其单个 RuvC 核酸酶结构域通过顺序机制产生双链 DNA 断裂，其中非靶链的初始切割随后是靶链切割。目前尚不清楚空间上相距甚远的 DNA 靶链如何向 RuvC 催化核心移动。在这里，连续数十微秒的分子动力学和自由能模拟表明，位于 RuvC 结构域内的 α 螺旋盖通过锚定 crRNA：靶链双链并引导靶链向 RuvC 核心移动，在 DNA 靶链的移动中起着关键作用，DNA 切割实验也证实了这一点。在这种机制中，REC2 结构域将 crRNA：靶链双链推向酶的核心，而 Nuc 结构域通过向内弯曲来帮助靶链在 RuvC 核心内的弯曲和调节。了解 Cas12a 活性背后的这一关键过程将丰富基础知识并促进进一步的基因组编辑工程策略。
Exait：可解释的个性化学习的可解释的人工智能工具
为了恢复Duchenne肌肉营养不良（DMD）的各种突变模式中的肌营养不良蛋白，已经研究了多外观跳过（MES）方法。但是，只有有限的技术可以诱导大量缺失，以覆盖几百千倍酶的目标外显子。在这里，我们利用CRISPR-CAS3系统进行了MES诱导，并表明双重CRRNA可以在肌营养不良蛋白外显子45-55个区域（340 KB）诱导大量缺失，可以应用于各种类型的DMD患者。我们开发了一种基于SSA的两种基于SSA的记者系统，用于富含基因组编辑的细胞群，并证明MES诱导恢复了具有三个不同突变的DMD-IPSC中的肌营养不良蛋白蛋白。全基因组测序和距离分析在推定的CRRNA结合位点附近未检测到未明显的脱靶删除。总的来说，双CRISPR-CAS3是通过MES诱导诱导巨大基因组缺失并恢复肌营养不良蛋白蛋白的有前途的工具。
使用 Cas12a 在果蝇中进行多重条件基因组编辑
* 共同第一作者 § 通讯作者：f.port@dkfz.de 和 m.boutros@dkfz.de 摘要 CRISPR-Cas 基因组工程通过以前所未有的简便性实现靶向基因组修饰，彻底改变了生物医学研究。在流行的模型生物果蝇中，基因编辑迄今为止完全依赖于原型 CRISPR 核酸酶 Cas9。其他 CRISPR 系统的出现可以扩大基因组靶空间，提供额外的调控模式，并能够在同一动物的不同细胞群中独立操作基因。我们在此描述了一个用于果蝇高效 Cas12a 基因编辑的平台。我们表明，来自 Lachnospiraceae 细菌的 Cas12a （而非 Acidaminococcus spec.）可以介导体内强大的基因编辑。与大多数 crRNA 结合时，LbCas12a 活性在较低温度下受到强烈抑制，因此只需调节温度即可控制基因编辑。 LbCas12a 可以直接利用紧凑的 crRNA 阵列，这种阵列比 Cas9 sgRNA 阵列更容易构建，从而有助于同时对多个靶位进行多重基因组工程。使用三个 crRNA 阵列靶向基因会导致功能丧失表型的诱导，其效率与最先进的 Cas9 系统相当。最后，我们表明 LbCas12a 的细胞类型特异性表达足以介导各种组织中严格控制的基因编辑，从而可以详细分析这种多细胞生物中的基因功能。Cas12a 基因编辑大大扩展了这种生物的基因组工程工具箱，并将成为对果蝇基因组进行功能注释的有力方法。这项工作还为在其他遗传上可驯服的生物中开发多重转基因 Cas12a 基因组工程系统奠定了基础。关键词：Cas12a、果蝇、Cas9、基因组工程、CRISPR、诱变