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CRISPR/Cas9 敲除质粒
CRISPR/Cas 系统是一种适应性免疫防御机制，古细菌和细菌利用该系统降解外来遗传物质。在这些生物体中，噬菌体的外来遗传物质被获取并整合到 CRISPR 基因座中 (1,2)。这种新物质也称为间隔物，可产生序列特异性片段，用于未来抵抗噬菌体感染。这些序列特异性片段被翻译成短 CRISPR RNA (crRNA)，并通过 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白的核酸酶活性引导互补入侵 DNA 的切割，该蛋白也由 CRISPR 基因座编码 (1,2)。II 型 CRISPR 系统的 Cas9 核酸酶具有 RNA 结合域、α 螺旋识别叶 (REC)、包括用于 DNA 切割的 RuvC 和 HNH 的核酸酶叶以及原间隔物相邻基序 (PAM) 相互作用位点 (1,2)。 crRNA 通过与 REC 叶内的桥螺旋结合与 Cas9 核酸酶形成复合物，并与 crRNA 的骨架形成多个盐桥 (1,2,3)。
cas9兔子mab
CRISPR相关蛋白9（CAS9）是RNA引导的DNA核酸酶，是Pyogenes链球菌CRIS-CRISPR-antivirAniviral免疫系统的组成部分，可提供针对外肌小体遗传材料的适应性免疫。CRISPR抗病毒作用的机制涉及三个步骤：（i）宿主细菌获取外国DNA； （ii）CRISPR RNA（CRRNA）的合成和成熟，然后形成RNA-CAS核酸酶 - 蛋白质复合物； （iii）通过宿主细菌获取外源DNA；该络合物识别出外源DNA，并通过CAS核酸酶活性通过裂解而定向干扰。II型CRISPR/CAS抗病毒免疫系统为精确的基因组编辑提供了强大的工具，并具有特定调节基因和治疗应用的潜力。必须在细胞中引入或表达CAS9蛋白和引导RNA（包括CRRNA和反式激活CRRNA（tracroRNA）之间的融合）。导向RNA的5'末端的20个核苷酸序列将Cas9引导到特定的DNA靶位点。因此，可以“编程” Cas9以在体外以及细胞和生物中切割各种DNA位点。CRISPR/CAS9基因组编辑工具已用于包括小鼠和人类细胞在内的许多生物中。研究表明，CRISPR可用于在啮齿动物和灵长类动物胚胎干细胞中产生突变等位基因或报告基因。
用于检测细胞内病原体毒力基因的多重 CRISPR 干扰工具
在没有靶标切割的情况下，催化失活的 dCas9 通过在空间上阻止 CRISPR (cr)RNA 指向的给定基因上的 RNA 聚合酶活性来施加转录基因抑制。这种基因沉默技术称为 CRISPR 干扰 (CRISPRi)，已用于各种细菌物种以检测基因，主要是单独或成对检测。在这里，我们在病原体 Legionella pneumophila 中开发了一个多路复用 CRISPRi 平台，能够同时沉默多达十个基因。通过将强进行性启动子与重复/间隔序列上游的 boxA 元素相结合，克服了 Rho 依赖性转录终止对前体 crRNA 表达的限制。使用针对毒力蛋白编码基因的 crRNA，我们证明 CRISPRi 不仅在无菌培养基中生长期间完全发挥作用，而且在巨噬细胞感染期间也完全发挥作用，并且 CRISPRi 的基因耗竭完全重现了缺失菌株的生长缺陷。重要的是，通过改变重复/间隔序列中 crRNA 编码间隔序列的位置，我们的平台实现了目标的逐渐消耗，这反映在表型的严重性上。因此，多重 CRISPRi 有望用于大量探测大量基因，以破译 L. pneumophila 和其他细菌病原体的毒力策略。
一种用于识别和量化单个 CpG 甲基化位点的 CRISPR/Cas12a 辅助体外诊断工具
成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/相关核酸酶 (Cas) 的优异特异性和选择性是由 CRISPR RNA (crRNA) 的可互换间隔序列以及靶序列和 crRNA 序列之间的错配位置和数量决定的。某些疾病的特征是表观遗传改变而不是核苷酸变化，因此不适合 CRISPR 辅助传感方法。在这里，我们展示了一种体外诊断工具，通过使用甲基化敏感的限制性酶 (MSRE) 然后进行 Cas12a 辅助传感来区分 DNA 中的单个 CpG 位点甲基化。非甲基化序列被 MSRE 消化，导致靶序列碎片化，从而影响 crRNA 和靶 DNA 之间的 R 环形成。我们表明，片段大小、片段位置和片段数量会影响随后对单链 DNA (ssDNA) 的附带反式切割活性，从而可以从切割活性中推断出甲基化位置。利用 MSRE 与 Cas12a 结合，可以确定癌症基因的单个 CpG 位点甲基化水平。Cas12a 和 MSRE 的模块化为 Cas12a - MSRE 组合传感方法提供了高度的多功能性，这为轻松快速地研究单个 CpG 甲基化位点以进行疾病检测提供了可能性。
CRISPR技术结合了放大策略：核酸，蛋白质和小分子的分子测定
（crRNA）或单个诱导RNA（SGRNA）将CAS ector蛋白引导至用于加工的特定核酸序列，例如，结合和/或裂解。在CRISPR - CAS技术之前，其他核酸结合蛋白，例如锌nger核酸酶（ZFN），6个转录激活剂核酸蛋白酶（tal-ens），7和8个转录激活蛋白，8个，8个，8次，工程为与特定c c and c cy c c c c c c c demomic cynomic cytemic cytemic contimic contimic cypeci c necy。9,10麦尿素，例如laglidadg归核核酸内切酶，特定识别14至40个碱基对的双链DNA序列，并启用DNA序列的修改和缺失。8个ZFN要求将多个锌nger基序连接起来，每个基序都针对一个核苷酸三重态。10 Talens需要一个DNA结合结构域，其中每个氨基酸与四种类型的核苷酸之一的特异性结合。10这些系统需要针对不同目标位点的工程不同的融合蛋白，因此并不广泛适用。CRISPR - CAS技术克服了这个问题。可以通过使用设计用于识别基因序列的cRRNA来实现不同的基因序列。CRRNA介导的CRISPR指导的可编程特征尤其有利。因此，CRISPR - CAS
基因组编辑——Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统
图 1. Alt-RTM CRISPR-Cas9 系统核糖核蛋白的表现优于其他瞬时 CRISPR-Cas9 编辑方法。人类、小鼠或大鼠的 Alt-R CRISPR HPRT 对照 crRNA 与 Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA 复合。将所得复合物与 Cas9 表达质粒、Cas9 mRNA 或 Cas9 RNP（包含与 crRNA 和 tracrRNA 预复合的 Alt-R Sp Cas9 核酸酶 3NLS）一起转染到人类 (HEK-293)、小鼠 (Hepa1- 6) 或大鼠 (RG2) 细胞系中。使用 T7EI 测定法进行的突变检测表明，Alt-R CRISPR-Cas9 RNP 的表现优于其他瞬时 Cas9 表达方法，并且与稳定表达 S. pyogenes Cas9 的参考 HEK-293–Cas9 细胞的表现相当。
基因编辑技术（CRISPR）
一旦间隔物被纳入，病毒再次攻击，CRISPR 的一部分就会转录并加工成 CRISPR-RNA 或“crRNA”。 CRISPR核苷酸序列作为模板产生互补的单链RNA序列。
从 CRISPR 靶向 RNA 编辑中获得的见解......
摘要：成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统，尤其是II型（Cas9）系统，在DNA打靶方面得到了广泛的发展，形成了一套成熟的精准基因编辑系统。但CRISPR-Cas系统在RNA上的基础研究和应用尚处于早期阶段。近期，CRISPR-Cas13 VI型系统的发现，为拓展RNA打靶技术提供了可能，具有广阔的应用前景。大多数VI型Cas13效应子具有双核酸酶活性，能催化前crRNA转化为成熟的crRNA，并产生较强的RNA切割活性。Cas13能特异性识别靶向RNA片段，激活Cas13/crRNA复合物进行侧切活性。 Cas13X蛋白是Cas13家族中最小的效应子，长度为775个氨基酸，由于其不受前间隔区侧翼序列（PFS）限制、易于包装、不造成永久性损伤，是一种很有前途的RNA靶向平台。本研究重点介绍了CRISPR-Cas13家族靶向RNA编辑的最新进展，并讨论了Cas13在基础研究、核酸诊断、核酸追踪和遗传病治疗中的应用。此外，我们阐明了Cas13蛋白家族的结构及其分子机制，并提出了CRISPR-Cas13家族靶向RNA编辑的未来愿景。