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患者IPSC中的基因组编辑纠正了最普遍的USH2A突变，并揭示了有趣的突变mRNA表达曲线
遗传性视网膜营养不良（IRD）的特征是进行性光感受器变性和视力丧失。Usher综合征（USH）是一种综合征IRD，其特征是色素性视网膜炎（RP）和听力损失。USH在临床和基因上是异质的，最普遍的病因基因是USH2A。USH2A突变还解释了大量孤立的常染色体隐性RP（ARRP）病例。这种高预期是由于两个经常性的USH2A突变引起的，C.2276G> T和C.2299delg。由于USH2A cDNA的大尺寸，基因增强疗法是无法访问的。但是，CRISPR/CAS9介导的基因组编辑是可行的替代方法。我们使用了增强的链球菌链球菌（ESPCAS9）的特异性CAS9来成功实现诱导多能干细胞（IPSC）患者的两个最普遍的USH2A突变的无缝校正。我们的结果强调了促进ESPCAS9的高目标效率和特种型的功能。一致地，我们没有在校正后的IPSC中识别出任何非靶诱变，这些诱变也保留了多能性和遗传稳定性。此外，对USH2A表达的分析出乎意料地识别了与C.2276G> T和C.229999delg突变相关的异常mRNA水平，这些突变在校正后恢复。综上所述，我们有效的CRISPR/CAS9介导的USH2A突变校正策略为USH和ARRP患者提供了潜在治疗的希望。
从非合成性USH2A相关性视网膜炎的患者
众所周知，这是由于USH2A中存在“视网膜特异性”等位基因的原因。因此，出现至少一份视网膜特异性等位基因副本的患者将出现孤立的RP表型。高度复发的c.2276g> t突变是视网膜特异性等位基因（Lenassi等，2015）。在这里，我们报告了IPSC系列的生成，该患者从ARRP出现的患者和复合het erozygous c.2276g> t等位基因和另一个错位等位基因，C.7352 t> c，据我们所知，以前是未报告的。从患者皮肤活检中分离出人真皮成纤维细胞，并使用非整合性细胞调整-IPS 2.0 sendai重编程套件对重编程进行了重新编程。该套件包含仙台病毒（SEV）载体汽车，将OCT3/4，SOX2，KLF4和C-MYC转基因赋予了多脂能力。转变后三到四个星期，基于形态标准单独选择了类似IPSC的菌落。选择了Inmi005-A IPSC系列以进一步特征，因为它具有典型的IPSC菌落形态，该形态的紧密堆积的小细胞被尖锐的边界包围（图1 a）。使用逆转录（RT）-PCR确定外源载体的损失（图1 b）。通道12（p12）在SEV基因组和KLF4，KOS和C-MYC Cassettes的RT-PCR结果为阴性，类似于非转导的成纤维细胞，用作阴性对照。相比之下，被用作阳性对照的转导的成纤维细胞（纤维 + SEV）对四个靶标呈阳性。我们进行了
不同的光强度对胸腺法拉利的形态学，植物化学，挥发性化合物和基因表达的影响。
S3图 用VPA，LI2CO3和Tranilast处理的处理可减少DNA双链断裂，如！ H2AX，但不恢复HMGB-1水平。 （a）非播（ns），复制性衰老的未处理（RS UNTR）和复制性衰老处理（RS处理）细胞的免疫荧光染色（蓝色）和！ H2AX（绿色）以量化DNA双链断裂。 绿色！ H2AX与DAPI相对于总细胞计数进行了量化。 （b）非播（ns），复制性衰老的未处理（RS UNTR）和复制性衰老处理（RS处理）细胞的免疫荧光染色（蓝色）和HMGB-1（绿色）。 DAPI与总细胞计数相关的HMGB-1阳性细胞数量。S3图用VPA，LI2CO3和Tranilast处理的处理可减少DNA双链断裂，如！H2AX，但不恢复HMGB-1水平。（a）非播（ns），复制性衰老的未处理（RS UNTR）和复制性衰老处理（RS处理）细胞的免疫荧光染色（蓝色）和！H2AX（绿色）以量化DNA双链断裂。绿色！H2AX与DAPI相对于总细胞计数进行了量化。（b）非播（ns），复制性衰老的未处理（RS UNTR）和复制性衰老处理（RS处理）细胞的免疫荧光染色（蓝色）和HMGB-1（绿色）。DAPI与总细胞计数相关的HMGB-1阳性细胞数量。
精子衍生的 H2AK119ub1 是非洲爪蟾胚胎发育所必需的
23 多梳抑制复合物-1 沉积的 H2AK119ub1 在体细胞中启动兼性异染色质形成过程中起着关键作用。我们在此评估精子衍生的 H2AK119ub1 对胚胎发育的贡献。我们发现，在非洲爪蟾中，H2AK119ub1 在精子发生过程中以及胚胎发育早期都存在，这突出表明了其在精子向胚胎传递表观遗传信息方面发挥的作用。在注射到卵子之前，用 H2AK119ub1 去泛素化酶 USP21 对精子进行体外处理会导致与基因上调相关的发育缺陷。精子 H2AK119ub1 编辑会破坏卵子因子介导的父系染色质重塑过程。它导致复制后 H2AK119ub1 在基因组重复元件上积累，而不是在 CpG 岛上。精子表观基因组编辑引发的复制后 H2AK119ub1 分布的这种变化导致 USP21 处理精子产生的胚胎中 H2AK119ub1 基因失调。我们得出结论，精子来源的 H2AK119ub1 指导卵子因子介导的父系染色质表观遗传重塑，是胚胎发育所必需的。
Prime Editors 可精确纠正与 RHO 和 USH2A 相关的视网膜色素变性中的致病突变并防止视网膜变性
视网膜色素变性 (RP) 是一组罕见的遗传性退行性眼病，影响着全球多达 150 万人。RP 是由影响视网膜的多个基因突变引起的，导致视力逐渐丧失，最终失明，症状通常在儿童时期显现，目前无法治愈。RP 的特征是双侧视杆感光细胞丧失，随后视锥感光细胞继发丧失，视网膜色素上皮 (RPE) 变性。RHO 介导的常染色体显性 RP 是由编码视紫红质的基因突变引起的，视紫红质是一种光敏 G 蛋白偶联受体，可启动视杆感光细胞中的光转导级联 (Zhen 等人，2023 年)。USH2A 基因突变是常染色体隐性 RP 和 Usher 综合征的主要原因。 USH2A 编码 usherin，这是一种跨膜蛋白，主要在视网膜的感光层、耳蜗的毛细胞和许多组织的基底膜中产生（Li et al. 2022）。
T细胞的表位，短H2a组蛋白变体
通过分析来自各种癌症患者的数据，弗雷德·哈奇癌中心的杰伊·萨尔西（Jay Sarthy）小组已将短的H2A组蛋白变体确定为内源性的酒精酮和新型癌症睾丸抗原。简短的H2A（SH2A）组蛋白中所识别的变体具有与常见HLA等位基因结合的能力，因此充当免疫疗法的极好靶标。通过将SH2A变体与规范序列进行比较，发明家已经鉴定出经常与癌症相关的SH2A变体，并且在扩散的大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中很突出。可以将针对这些表位的转基因T细胞受体的发展用于CAR T细胞疗法来控制肿瘤的生长。使用这些新型表位的T细胞免疫疗法的潜力不仅可以用于治疗非霍奇金淋巴瘤，而且可以用作其他多种其他癌症的治疗方法。
评估心脏淀粉样变性临床途径的实施：现实世界经验
USH2A突变是常染色体隐性视网膜炎色素（RP）和Usher综合征的常见原因，目前尚无批准的治疗方法。基因增强是治疗许多遗传性视网膜疾病的宝贵治疗策略；然而，常规的腺相关病毒（AAV）基因疗法无法容纳超过4.7 kb的cDNA，例如15.6 kb-kb--kb-long-long ush2a编码序列。在本研究中，我们采用了一种替代策略来成功产生支架/矩阵附着区域（S/MAR）DNA质粒载体，其中包含全长人类USH2A编码顺序，GFP记者基因，以及一个泛质启动子（CMV或CAG）（CMV或CAG），达到了大约23 kB的大小。除了在一个细胞阶段与载体显微注射，我们还评估了转染的HEK293细胞和USH2A患者衍生的皮肤纤维细胞中的载体。ps/mar-ush2a载体通过恢复usherin的患者纤维细胞中持续的转基因表达。在USH2A U507 U507斑马鱼的光感受器中拯救了usher 2复合物定位，并在光疗细胞中检测到了十二个月的GFP表达。 据我们所知，这是第一个报道的向量，可用于用功能救援表达全长Usherin。 S/MAR DNA载体已显示出有望作为一种新型的非病毒视网膜基因疗法，需要进一步的转化发展。在USH2A U507 U507斑马鱼的光感受器中拯救了usher 2复合物定位，并在光疗细胞中检测到了十二个月的GFP表达。据我们所知，这是第一个报道的向量，可用于用功能救援表达全长Usherin。 S/MAR DNA载体已显示出有望作为一种新型的非病毒视网膜基因疗法，需要进一步的转化发展。据我们所知，这是第一个报道的向量，可用于用功能救援表达全长Usherin。S/MAR DNA载体已显示出有望作为一种新型的非病毒视网膜基因疗法，需要进一步的转化发展。
在患者衍生的多能干细胞中的USH2A C.2299delg突变的产生和遗传校正
1美国迈阿密米勒大学医学院耳鼻喉科学系，美国佛罗里达州迈阿密，美国33136； zxh359@med.miami.edu（Z.H.）; ncg65@med.miami.edu（N.G。）2 John P. Hussman人类基因组学研究所，迈阿密米勒大学医学院，迈阿密，佛罗里达州33136，美国； ddykxhoorn@med.miami.edu 3迈阿密大学米勒大学医学院跨学科干细胞研究所，迈阿密，佛罗里达州佛罗里达州33136，美国4蜂窝转化研究核心，犹他大学临床与转化科学中心，犹他大学，美国盐湖城，盐湖城，盐湖城，美国犹他州84112； lillykvit@gmail.com（J.L。 ）; colin.maguire@utah.edu（c.t.m.） 5耳鼻喉科和头颈外科，以及神经科学的计划，哈佛医学院和伊顿·皮博迪实验室，马萨诸塞州的眼睛和耳朵，一级，美国马萨诸塞州波士顿，美国马萨诸塞州02114； wenliang_zhu@meei.harvard.edu 6眼科与视觉科学系，约翰·A·莫兰眼中中心，犹他大学，盐湖城，盐湖城，美国犹他州84132，美国； anna.clark@hsc.utah.edu *通信：xliu@med.miami.edu（X.L. ） ）; zheng-yi_chen@meei.harvard.edu（z.-y.c. ）; jun.yang@hsc.utah.edu（J.Y。 ）;电话。 ： +305-243-1484（X.L. ）; +617-573-3673（Z.-Y.C. ）; +801-213-2591（J.Y。 ）;传真： +305-243-2009（X.L.） †同等贡献。2 John P. Hussman人类基因组学研究所，迈阿密米勒大学医学院，迈阿密，佛罗里达州33136，美国； ddykxhoorn@med.miami.edu 3迈阿密大学米勒大学医学院跨学科干细胞研究所，迈阿密，佛罗里达州佛罗里达州33136，美国4蜂窝转化研究核心，犹他大学临床与转化科学中心，犹他大学，美国盐湖城，盐湖城，盐湖城，美国犹他州84112； lillykvit@gmail.com（J.L。）; colin.maguire@utah.edu（c.t.m.）5耳鼻喉科和头颈外科，以及神经科学的计划，哈佛医学院和伊顿·皮博迪实验室，马萨诸塞州的眼睛和耳朵，一级，美国马萨诸塞州波士顿，美国马萨诸塞州02114； wenliang_zhu@meei.harvard.edu 6眼科与视觉科学系，约翰·A·莫兰眼中中心，犹他大学，盐湖城，盐湖城，美国犹他州84132，美国； anna.clark@hsc.utah.edu *通信：xliu@med.miami.edu（X.L.）; zheng-yi_chen@meei.harvard.edu（z.-y.c.）; jun.yang@hsc.utah.edu（J.Y。）;电话。： +305-243-1484（X.L.）; +617-573-3673（Z.-Y.C.）; +801-213-2591（J.Y。）;传真： +305-243-2009（X.L.）†同等贡献。
CRISPR 基因编辑挽救了人类 USH2A 突变视网膜类器官的缺陷
• 作者要感谢所有 Editas 同事帮助规划、执行、分析和展示这项工作 • 作者非常感谢马萨诸塞州眼耳研究所 (MEEI) 的 Eric Pierce 博士和 Qi Liu 博士提供 USH2A 患者的外周血单核细胞，这些细胞以 iPSC 的形式用于本文介绍的研究 • 编辑协助由 2 the Nth（英国柴郡）的 Hilary Wong 博士提供，并由 Editas Medicine 资助
通过靶向组蛋白 H2A-K15 泛素化增强 CRISPR-Cas9 诱导的精准基因编辑
修改，例如疾病突变建模或体细胞基因治疗中突变的校正。为了加强精确的基因编辑，需要工具或干预措施使 DSB 修复途径选择偏向 HDR，并通过将 DNA 修复模板靶向递送到 DSB 来促进 HDR 处理。特别是修复模板的可用性可能是 HDR 的限速因素。以前用于靶向递送修复模板的方法使用 Cas9 融合蛋白，其结构域与功能基团结合，该功能基团被掺入合成寡核苷酸或 PCR 片段中作为供体模板，并作为组合的 Cas9-sgRNA-供体复合物递送到细胞中 [3-5]。然而，目前尚不清楚修复模板分子与 Cas9 核酸酶的连接是否是共递送的最有效方式，因为模板在 DSB 修复的后续步骤中是必需的。以前促进 DSB 修复途径选择的方法有利于