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CRISPR/Cas12a (Cpf1) 引导RNA序列的鉴定
CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）或 CRISPR 相关（Cas）系统已成为一种主要的基因编辑工具。使用 CRISPR 进行基因编辑需要 Cas 蛋白和相应的向导 RNA（gRNA）。然而，低切割效率和脱靶效应会阻碍 CRISPR/Cas 系统的应用。因此，确定特定的 gRNA 至关重要。在生物传感器应用中，由于 Cas12a（Cpf1）的反式切割活性，CRISPR/Cas12a 可以增强识别靶基因的特异性和灵敏度。mtDNA D 环序列是 mtDNA 中最易变的部分，使其适合区分物种。因此，本研究的目的是通过计算机模拟确定野猪 mtDNA D 环的 gRNA 序列。在 GenBank 数据库的帮助下，使用 Benchling 应用程序预测候选 gRNA。随后，使用 BLAST 核苷酸对 gRNA 候选物进行同源性差异分析，并使用 Jalview 进行错配测试。在几个候选物中，候选物 1 被选为最佳选择，脱靶值为 99.8。与竞争对手的同源性差异分析和与 Sus 属的错配测试分别产生了较高的 E 值和较高的百分比值。这表明候选物不会识别其他物种，但可以检测 Sus scrofa 物种的成员。这些 gRNA 候选物可以选择性地且灵敏地应用于生物传感器，以检测肉类掺假。
分支特异性基因和新颖性的进化起源
摘要 分支特异性（又称谱系特异性）基因非常常见，存在于所有分类学水平和所有被研究的分支中。它们可以通过复制先前存在的基因而产生，这可能涉及部分截断或与其他蛋白质结构域或调控序列的组合。它们也可以从非编码序列重新进化，从而产生潜在的真正新颖的蛋白质结构域。最后，由于分支特异性基因通常被定义为与其他蛋白质缺乏序列同源性，因此它们也可以通过足够快的序列进化而产生，以至于先前的序列同源性不再被检测到。在这种情况下，快速进化之后是限制，我们认为它们在本体论上是非新颖的，但在功能层面上可能是新颖的。一般来说，分支特异性基因较少受到生物学家的关注，但它们在重要性状中的作用的有趣例子越来越多。在这里，我们回顾了一些最近选定的例子，并认为对分支特异性基因的关注是对进化发育动物领域习惯的保守发育调控工具包的关注的重要纠正。最后，我们讨论了有关分支特异性基因进化的问题，以及未来研究如何解决这些问题。我们强调了这样的假设：与其他基因相比，分支特异性基因更有可能参与它们出现的主干群中出现的共衍生征。
蜜蜂肠道细菌共生体的一步基因组工程
摘要 由于缺乏易于使用的基因组工程方法，对包括蜜蜂微生物组在内的许多宿主-微生物系统相互作用的机制理解受到限制。为此，我们展示了一种一步到位的基因组工程方法，用于在蜜蜂肠道细菌共生体的染色体中进行基因删除和插入。线性或非复制性质粒 DNA 含有抗生素抗性盒，其两侧是与共生体基因组同源的区域，电穿孔可靠地导致染色体整合。这种轻量级方法不需要表达任何外源重组机制。使用现代 DNA 合成和组装方法可以轻松产生使该过程高效所需的具有长同源区域的高浓度大 DNA。我们使用这种方法敲除基因，包括参与生物膜形成的基因，并将荧光蛋白基因插入 betaproteo 细菌蜜蜂肠道共生体 Snodgrassella alvi 的染色体中。我们还能够对 S. alvi 的多个菌株和另一种物种 Snodgrassella communis 进行基因组改造，Snodgrassella communis 存在于大黄蜂肠道微生物群中。最后，我们使用相同的方法改造另一种蜜蜂共生体 Bartonella apis 的染色体，Bartonella apis 是一种 α-变形杆菌。正如预期的那样，使用这种方法对 S. alvi 进行基因敲除依赖于 recA，这表明这种简单的程序可以应用于其他缺乏便捷基因组改造方法的微生物。
通过PCR协议形式的基因分型
等位基因描述：使用优化的CRISPR CAS9 KI技术创建了鼠标R565Q模型，该技术利用核糖核蛋白（RNP）在存在带有所需KI的合成单链DNA修复模板的情况下创建了。zygotes被电穿孔，并通过同源性修复（HDR）筛选后后代，以确定正确靶向等位基因的存在。Ki核苷酸破坏了PAM位点（NGG），为4和5 bp，与裂解位点并设计为SSODN，以保护HDR衍生的基因座免受CAS9自动切割。关键后代。
水生生物疾病 62:255
摘要：传统上，螺原体仅从花和其他植物部位的表面、各种昆虫的内脏和血淋巴以及维管植物的液体（韧皮部汁液）和以这些液体为食的昆虫中分离出来。在本文中，我们报告了在虾中发现的第一种致病螺原体，以及通过组织学评估、原位杂交测定、透射电子显微镜、16S rRNA 序列同源性和注射感染性研究对其进行表征的结果。此外，还介绍了为检测这种微生物而开发的分子方法，该微生物被确定为哥伦比亚养殖的南美白对虾的病原体，导致其死亡率很高。使用标准组织学方法和原位杂交测定，证实南美白对虾感染了这种致病螺原体。组织学分析显示受影响器官/组织出现全身性炎症反应。为了鉴定细菌，使用来自初始流行区的冷冻感染南美白对虾样本对 16S rRNA 基因进行测序并开发分子检测方法。通过 PCR 扩增 16S rRNA 基因，然后进行测序。使用 GenBank BLAST 搜索分析序列数据，结果显示与柑橘树病原体柑橘螺原体有 98% 的同源性。对 16S rRNA 序列数据进行评估以开发针对假定螺原体的独特 PCR 引物。使用针对螺原体属的螺旋素基因开发的 PCR 引物，开发并测试了地高辛标记的探针。该探针是物种特异性的，与以此形式测试的其他细菌样本没有发生阳性反应或交叉反应。
CRISPR/Cas9 介导大转基因整合至猪 CEP112 基因座
摘要 成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 相关蛋白 9 (Cas9) 是一种精确的基因组操作工具，可在各种细胞和生物体中产生靶向基因突变。尽管 CRISPR/Cas9 可以有效地产生基因敲除，但同源定向修复介导的基因敲入 (KI) 效率仍然很低，尤其是对于大片段整合。在本研究中，我们建立了一种有效的方法，用于 CRISPR/Cas9 介导的大型转基因盒整合，该盒携带唾液腺表达的多种消化酶 (20 kbp) 在猪胎儿成纤维细胞 (PFF) 的 CEP112 基因座中。我们的结果表明，使用具有短臂和长臂的最佳同源供体在 CEP112 基因座中产生了最好的 CRISPR/Cas9 介导的 KI 效率，并且 CEP112 基因座的靶向效率高于 ROSA26 基因座。CEP112 KI 细胞系被用作核供体，进行体细胞核移植以创建转基因猪。我们发现 KI 猪 (705) 在唾液腺中成功表达三种微生物酶 (b-葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶)。这一发现表明 CEP112 基因座通过组织特异性启动子支持外源基因表达。总之，我们利用我们的最佳同源臂系统成功地在猪体内靶向 CEP112 基因座，并建立了一种改良的猪唾液中表达外来消化酶的模型。
OMV 研发肌肉注射疫苗预防淋病
有证据表明，针对 B 组脑膜炎球菌感染的 4CMenB 疫苗也能在一定程度上预防淋病。3,4 使用该疫苗可减少诊断和住院。5 Avacc 12 利用了这种保护机制。该疫苗使用 Intravacc 的脑膜炎奈瑟菌 B 血清群平台（该平台与淋病奈瑟菌具有 90% 的整体同源性并共享许多外膜抗原）来诱导对淋病的交叉保护。脑膜炎奈瑟菌经过额外改造，可以用淋球菌抗原替代脑膜炎抗原，从而进一步提高疫苗的有效性。
暑期课堂上通过视觉选择对果蝇进行 CRISPR/Cas9 基因编辑
(A) 顶部：将目标 Gal4（深蓝色，顶部构建体）与编码 Cas9 的版本 2 (V2) 供体菌株杂交，该菌株由 X 上的 vasa 启动子控制（未显示），而 CyO 上的供体构建体则包含 T2A。LexA 由 floxed 3xP3-RFP、黄色+ 盒标记，两侧是 Gal4 同源臂和 U6 驱动的向导 RNA（CyOHACKy.V2,y +、RFP +）。从上往下第三行：得到的 HACKed 染色体，其中 Gal4 ORF 已被破坏并由 T2A.LexA 替换，由视觉标记黄色+和 RFP+标记。底部：与 hs- Cre 杂交后，黄色 +、RFP + 盒被移除。
通过 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白和基于 URA3 的标记回收对炭疽菌进行有效的多基因敲除
图 1. CRISPR-Cas9 RNP 促进 C. higginsianum 中与供体 DNA 的同源重组。（a）CRISPR-Cas9 RNP 介导的 HDR 示意图。首先，将重组 Cas9 蛋白（橙色）和针对目的基因 (GOI) 的合成 gRNA（洋红色）在体外混合以形成 RNP。其次，用 RNP 和供体 DNA 转化 C. higginsianum 原生质体，其中供体 DNA 具有选择标记 NPTII，两侧是两个同源臂。最后，通过结合选择培养基和基于 PCR 的筛选来分离用选择盒替换 GOI 的菌株。（b）URA3 敲除的构建设计。供体 DNA 具有选择标记，即 NPTII 表达盒，两侧是 0.5 kb 的同源臂，以浅灰色框表示。箭头表示扩增 ura3 基因组中特异性存在的“片段 1”和“片段 2”的引物。（c）转化子数量和 URA3 敲除率。左图显示每板转化子数量，右图显示每板 URA3 敲除率（n =5）。“-gRNA”和“+gRNA”分别代表不含和含 gRNA 的结果。星号表示统计差异（p < 0.001，Welch t 检验）。通过 PCR 筛选评估 URA3 的敲除，如 (d) 所示。（d）ura3 突变体的 PCR 筛选。使用 (b) 中所示的引物组，在含有 500 µg/ml G418 的 MA 上使用每个菌落进行 PCR。显示了从 -gRNA 和 +gRNA 转化子中随机选择的七个菌落的结果。 C. higginsianum 肌动蛋白基因 (CH63R_04240) 的 238 bp 片段被指定为肌动蛋白。凝胶左侧的数字表示 DNA 大小标记 (bp) 的位置。
有关前列腺癌诊断的同源持久特征的机器学习技术
摘要图像处理设备和技术的快速演变确保了新型图片分析方法的发展。是测量功能拓扑特性的最强大但计算可能的代数技术之一是持续的同源性。这是一个代数不变的，可以在不同的空间分辨率下捕获拓扑细节。持续的同源性使用一组采样点（例如像素）研究了空间的拓扑特征。它可以跟踪由被称为过滤的操作产生的嵌套空间变化引起的拓扑特征的外观和消失，在这种操作中，在我们的情况下，参数量表增加了像素的强度，以检测在各种尺度范围内研究空间的变化。此外，在机器学习的层面上，最近有许多研究和文章目睹了同源性持久性与机器学习算法之间的结合。在另一个层面上，前列腺癌被诊断为描述称为格里森评分的癌症严重程度的评分标准。经典的格里森系统定义了五种组织学生长模式（等级）。在我们的研究中，我们建议研究从新的光学显微镜技术发行的一些腺体上的格里森评分，称为Slim。这种新的光学显微镜技术在光成像中结合了两个经典的思想：Zernike的相比显微镜和Gabor的全息图。在这些图像上计算持续的同源性特征。我们建议将这些图像分类为相应的格里森评分。在同源持久性特征上应用的机器学习技术在这些图像中检测前列腺癌的正确格里森评分非常有效，并且表现出高于95％的精度。