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介导 1bp 分辨率的插入/缺失突变 F
。CC-BY-NC 4.0 国际许可证永久有效。它是在预印本（未经同行评审认证）下提供的，作者/资助者已授予 bioRxiv 许可，可以在该版本中显示预印本。版权所有者于 2022 年 2 月 7 日发布了此版本。；https://doi.org/10.1101/2022.02.07.479376 doi：bioRxiv 预印本
数字液滴 PCR 和 IDAA 用于检测疟疾物种斯氏按蚊中的 CRISPR 插入/缺失编辑
摘要 CRISPR/Cas9 技术是设计基因驱动系统以控制和/或改变蚊媒种群的有力工具；然而，CRISPR/Cas9 介导的非同源末端连接突变可能对产生抗驱动的等位基因产生重要影响，从而对驱动效率产生重要影响。我们展示并比较了两种技术在疟疾媒介蚊子斯氏按蚊中的插入或缺失 (indel) 检测能力：扩增子分析插入缺失检测 (IDAA™) 和液滴数字™ PCR (ddPCR™)。这两种技术在含有不同比例和不同大小的插入缺失的蚊子样本中都显示出插入缺失频率的准确性和可重复性。此外，这些技术具有优势，使它们可能更适合在基因驱动蚊子的笼养试验和封闭式现场测试中进行高通量非同源末端连接分析。
通过 ddRAD-seq 和重测序分析检测生菜中的候选基因 LsACOS5 并开发雄性不育的 InDel 标记
利用雄性不育性进行 F 1 杂交的新育种方法将为自花授粉作物莴苣育种开辟一个令人兴奋的新领域。雄性不育性是 F 1 杂交育种的一个关键性状。绘制利用雄性不育性的致病基因图谱至关重要。“CGN17397”的 ms-S 雄性不育 (MS) 基因通过 ddRAD-seq 定位到连锁群 (LG) 8，并使用两个 F 2 群体将其缩小到两个标记之间。该区域跨越约 10.16 Mb，其中根据莴苣参考基因组序列（版本 8 来自“Salinas”）注释了 94 个基因。 MS 系“CGN17397-MS”和雄性不育 (MF) 系“CGN17397-MF”的全基因组测序表明，只有一个基因在 Lsat_1_v5_gn_8_148221.1 区域有所不同，该基因是酰基辅酶 A 合成酶 5 (ACOS5) 的同源物，并且在 MS 系中被删除。据报道，ACOS5 是花粉壁形成所必需的，并且 ACOS5 的无效突变体在某些植物中完全是雄性不育的。因此，我得出结论，指定为 LsACOS5 的 Lsat_1_ v5_gn_8_148221.1 是 ms-S 基因座的生物学上合理的候选基因。利用 LsACOS5 的结构多态性，开发了 InDel 标记来选择 MS 性状。这里获得的结果为生菜的基因雄性不育提供了有价值的信息。
利用 DNA-PKcs 抑制技术在人类原代细胞中通过同源性定向修复实现高效转基因整合
基于核酸酶的基因组编辑的治疗应用将受益于通过同源定向修复 (HDR) 进行转基因整合的改进方法。为了提高 HDR 效率，我们筛选了六种 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基 (DNA-PKcs) 的小分子抑制剂，DNA-PKcs 是替代修复途径非同源末端连接 (NHEJ) 中的关键蛋白，可产生基因组插入/缺失 (INDEL)。从这次筛选中，我们确定 AZD7648 是最有效的化合物。使用 AZD7648 可显著增加 HDR（高达 50 倍）并同时降低各种治疗相关的原代人类细胞类型中不同基因组位点的 INDEL。在所有情况下，HDR 与 INDEL 的比率均显著增加，并且在某些情况下，实现了无 INDEL 的高频 (>50%) 靶向整合。这种方法有可能提高基于细胞的疗法的治疗效果并扩大靶向整合作为研究工具的使用范围。
TSA促进CRISPR/CAS9的编辑效率和细胞分裂基因的表达，来自植物原生质体
摘要：Trichostatin A（TSA）是一种代表性的组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）抑制剂，该抑制剂通过调节细胞中的染色质重塑来调节表观遗传基因的表达。调查TSA对染色质DE稳态的调节是否会影响Cas9蛋白 - 蛋白 - 核核糖核蛋白（RNP）的效率提高，从植物细胞中检查了基因组编辑的基因组，使用生菜和烟草原子量进行了多种浓度，在几次浓度的TSA治疗后（tsa）（0.1）（0.1）（0.1和10，0.1）。RNP从原生质体递送。有趣的是，在莴苣原生质体中，TSA处理中SOC1基因的indel频率是DMSO处理的3.3至3.8倍。尽管没有太大差异，但糖基因原生质体中SOC1基因的indel频率的增加发生在浓度依赖性的方式中。类似于生菜，TSA在PDS基因组编辑期间使用烟草原生质体以浓度依赖性方式将indel频率提高了1.5至1.8倍。MNase测试清楚地表明，使用TSA处理的染色质可及性高于DMSO治疗的染色质。此外，TSA处理显着提高了生菜原生质体的组蛋白H3和H4乙酰化水平。QRT-PCR分析表明，通过TSA处理，增加了细胞分裂相关基因的表达（LSCYCD1-1，LSCYCD3-2，LSCYCD6-1和LSCYCU4-1）。这些发现可能有助于提高CRISPR/CAS9介导的基因组编辑的效率。此外，这可以应用于使用带有植物原生质体的CRISPR/CAS9系统开发有用的基因组编辑的作物。
使用EXO-CIP™快速PCR清理套件处理的PCR扩增子对基因组编辑效率进行快速分析，然后是Sanger测序
对于CRISPR/CAS工作流程，核酸酶和相应GRNA的选择直接影响基因组编辑后的indel频率的计算。当前用于评估编辑效率的当前METH OD使用来自转染的细胞的合并GDNA的PCR扩增，然后是基于测序或基于测序的基于测序或基于不匹配的裂解的分析分析的变性和重新启动的indneal indneal indneal DNA（4）。为加快编辑效率的确定并避免昂贵的NG测序，“通过分解来跟踪Indels”（Tide）（5）和“ CRISPR编辑的推断”（ICE）方法（6）是开发用于使用sanger sequenc dna sequenceenc dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna（ice）方法（ICE）方法（ICE）方法（ICE）。但是，要使这些方法可靠，分析的PCR产品必须具有高质量（例如，单个频带，没有底漆和DNTP）。在本文中，我们证明了通过Exo-CIP快速PCR清洁套件方法清理的扩增子质量匹配，该方法是通过使用ICE软件工具进行批处理分析的传统基于旋转柱的套件来实现的，从而启用了更快，更高的推出方法，以制备旋转后的样品，用于旋转后的样品。
基于 RNP 的原代 CD4+T 细胞编辑...
电穿孔后 72 小时，可使用 BioLegend APC 抗人 TCR α / β 抗体通过流式细胞术评估用靶向 Edit-R sgRNA RNP 的 TRAC 或 TRBC 编辑的原代 CD4 + T 细胞的 TCR α / β 敲除情况。除了通过流式细胞术读取表型外，在基于 RNP 的编辑后 48-72 小时内，可以通过 T7EI/TIDE 测量插入/缺失形成。使用表 1 中列出的每个经过验证的 sgRNA 的引物，遵循 Dharmacon™ Edit-R™ 合成 gRNA 阳性对照试剂盒方案中的直接细胞裂解和 PCR 条件。要测量 T7EI 内切酶的插入/缺失形成，请完成上面列出的方案并使用分析软件。要通过分解 (TIDE) 分析跟踪插入/缺失来测量插入/缺失形成，请将得到的 PCR 扩增子发送至 Sanger 测序并使用网络工具，例如 http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ 。以下方案描述了用于通过流式细胞术评估原代 CD4 + T 细胞中 TCR α / β 表型敲除的染色条件。1. 通过离心（300-5 分钟）沉淀用 PPIB、NTC2、TRAC 或 TRBC 靶向 RNP 电穿孔的 CD4 + T 细胞
通过GFP-Reporter测定法恢复单切SGRNA的敏感且可靠的评估
大多数Duchenne肌肉营养不良（DMD）病例是由一个或多个外显子的删除或重复引起的，这些外显子破坏了DMD mRNA的阅读框架。恢复阅读框允许产生部分功能性肌营养不良蛋白，并导致症状不太严重。反义寡核苷酸介导的外显子跳过已被批准用于DMD，但是该策略需要重复治疗。crispr/cas9还可以恢复室内读取框架。尽管最近的体内研究表明单切换/外显子跳过策略的功效，但缺乏找到特定突变的最有效的单切SGRNA的方法。在这里，我们表明插入/删除（Indel）产生效率和Indel曲线都有助于读取框架恢复单切SGRNA的效率，因此只检查Indel频率的测定无法找到最佳的SGRNA。因此，我们开发了一种GFP重复蛋白测定法，以评估单切性效率，并报告了这两个方面的综合效应。我们表明，GFP-Reporter分析可以可靠地预测肌细胞中SGRNA的性能。此GFP-报告基因测定法可以有效，可靠地找到最有效的单切SGRNA来恢复肌营养不良蛋白的表达。
生物信息学实验室 - 基因组装
即使使用SNP搜索工具，我们也不能依靠提出的变体。有一些结核分枝杆菌基因组的区域很难有效地映射，例如高度重复的PE / PPE / PGRS基因和IS（插入序列位点）。此外，当我们的样品中出现插入或缺失（Indel）相对于参考时，它可能会导致独特的核苷酸的假变体显得靠近Indel。最后，如果很少有序列映射到参考基因组的区域，这要么是由于缺失序列或由于基因组区域中的GC含量高，因此我们无法确定这些变体的鉴定质量。“ TB变体过滤器”工具可以根据各种标准（包括上面列出的标准）帮助过滤变体。
基准测试揭示了深度学习变体呼叫者对细菌纳米孔序列数据的优越性
摘要14变体调用在细菌基因组学中至关重要，鉴定了疾病的识别15传播簇，系统发育树的构造以及抗菌耐药性养育16。本研究使用牛津纳米孔技术（ONT）和Illumina 18测序对14种不同细菌种类的SNP和INDEL变体进行了全面的基准测试。我们生成金标准参考基因组和项目变化，从密切的19个相关菌株上产生了它们，从而创建了SNP和Indels的生物学现实分布。20我们的结果表明，与传统方法和Illumina相比，基于深度学习的工具的Ont变体调用提供了更高的21 SNP和Indel精度，而Clair3总体上提供了最多的AC-22策展结果。我们研究了错过和错误呼叫的原因，突出了简短读取中固有的限制23，发现Ont的传统限制与均聚物 - 24诱导的Indel错误无关，而高准确的基本模型和深度学习的基于深度学习的25个变体呼叫。此外，我们对读取深度对变体的影响的发现提供了价值26个能力的洞察力，用于对资源有限的测序项目进行测序，这表明10倍深度足够27，以实现匹配或超过Illumina的变体呼叫。28总而言之，我们的研究强调了SNP和Indel 29检测中的深度学习工具的卓越准确性，从而挑战了短阅读测序的至高无上。32系统错误的减少30及在较低的读取深度达到高精度的能力增强了31次通过在临床和公共卫生细菌基因组学中广泛使用的ONT的能力。