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Bravo Agilent Avida靶向富集的高吞吐量检测基因组改变和DNA甲基化
液体活检中癌组织DNA或CFDNA（无细胞DNA）的当前基因组和表观基因组分析依赖于单独的，时间和样品耗尽的技术来进行体细胞变异检测或甲基化分析。在这里，我们描述了使用Agilent Avida靶向富集溶液进行体细胞和甲基化分析的敏捷Bravo自动化液体处理平台的工作流程和性能。该溶液可以有效地分析低输入肿瘤DNA或CFDNA样品。Avida Duo工作流程可以高度敏感地检测单核苷酸变体（SNV），插入和缺失（Indel），拷贝数变化（CNV），转运（TL）和DNA甲基化谱，而没有任何样品分开。
使用 CRISPR-Cas9 修饰染色质以增强基因组编辑
摘要 CRISPR 相关 (Cas) 酶通过实现 RNA 引导的基因组编辑彻底改变了生物学。在供体模板存在下进行同源定向修复 (HDR) 目前是 CRISPR-Cas 诱导的双链 DNA 切割后引入精确编辑的最通用方法，但 HDR 效率通常低于导致插入和缺失 (indel) 的末端连接途径。我们测试了使用与 PRDM9 融合的 Cas9 构建体可以增加 HDR 的假设，PRDM9 是一种染色质重塑因子，可沉积组蛋白甲基化 H3K4me3 和 H3K36me3，经证实可介导人类细胞中的同源重组。我们的结果表明，融合蛋白特异性地在 DNA 中的 Cas9 切割位点接触染色质，使观察到的 HDR 效率加倍，并将 HDR：indel 比率提高 3 倍，与单独使用 Cas9 诱导的相比。HDR 增强发生在多种细胞系中，脱靶基因组编辑没有增加。这些发现强调了染色质结构对于 CRISPR-Cas 基因组编辑过程中 DNA 修复途径选择的重要性，并提供了一种提高 HDR 效率的新策略。意义声明 CRISPR-Cas 介导的同源定向修复 (HDR) 可为各种研究和临床应用提供精确的基因组编辑，但由于竞争性端接途径，HDR 效率通常较低。在这里，我们描述了一种通过设计 CRISPR-Cas9-甲基转移酶融合蛋白来影响 DNA 修复途径选择并提高 HDR 效率的简单策略。该策略强调了组蛋白修饰对 CRISPR-Cas 诱导的双链断裂后 DNA 修复的影响，并增加了 CRISPR 基因组编辑工具箱。
Deeplex Myc-TB 示例报告
基因靶标中检测到的变异或插入/缺失（indel）及其颜色代表的亚群百分比；基因靶标中未检测到变异或插入/缺失，或仅检测到与耐药性无关的变异或插入/缺失；基因靶标覆盖率不理想；鉴定为非结核分枝杆菌（NTM）。分枝杆菌检测到的变异或插入/缺失通过最外层的密码子、氨基酸或核苷酸变化（缺失显示为*）指定，使用与上述相同的颜色代码表示耐药性相关和未表征的类别，或使用灰色（ ）表示与耐药性无关的变异或插入/缺失。目标参考序列根据基因靶标覆盖率着色如下：覆盖率>95%，覆盖率<95%。每个目标的检测限直方图的颜色编码如下：1%检测限3%，3%检测限80%。≤≤<≤
使用 Dharmacon Edit- 对斑马鱼胚胎进行显微注射……
图 1：微注射 Edit-R Cas9 核酸酶 mRNA 和合成 crRNA:tracrRNA 的斑马鱼胚胎具有可检测的编辑事件。仅微注射 Edit-R Cas9 mRNA（+/+ 泳道）或微注射 Edit-R Cas9 mRNA 加靶向 GFP 的 crRNA:tracrRNA（+ 泳道）。注射后 2 天制备基因组 DNA，并使用位于切割位点两侧的引物进行 PCR。使用 T7EI 进行 DNA 错配分析，并在 2% 琼脂糖凝胶上分离样品。使用 ImageJ 软件估计由于基因编辑而导致的插入和缺失百分比 (Indel %)，并显示在泳道底部。在所分析的斑马鱼胚胎中，75% 实现了使用靶向 GFP 的 crRNA:tracrRNA 编程的 Cas9 mRNA 的靶向 DNA 切割。
化学疗法对正常血细胞的长期作用
图2 |正常和化学疗法暴露的血细胞中的突变负担和突变信号。a，正常（蓝色）年龄（年龄）的单个基本替代负担和四种化疗（红色）个体，具有最高的indel负担。盒子表示中位数和四分位间范围，晶须表示最小值和最大值，点代表外围值。蓝线代表了未暴露的个体突变负担的年龄的回归，其阴影为95％。b，如a中的数据描述，但y轴在2000个单碱基取代处被切断，以更好地可视化大多数数据。c，使用HDP从正常和化学疗法暴露的HSPC菌落的完整数据集中提取的突变特征和大量成熟血细胞亚群的双工测序。
新英格兰Biolabs分析证书
在许多DIY基因合成工作流中，用户通过购买合成的dsDNA（例如Gblocks）或准备重叠的寡核体的扩增子来获得用于组装的片段。通常，这些部分具有直接由用于生成碎片的寡核苷酸引起的残余误差。身份酸酶将减少/去除来自扩增子的不匹配/indel（插入/缺失）区域，这些区域源自寡核苷酸化学合成过程中掺入的误差。以下方案增加了经酶校正的DNA池中正确片段的群体，然后允许DNA聚合酶扩增以更准确性和效率富集扩增子。校正和富集步骤的组合增强了组装基因合成的质量，从而用所需的正确的DNA序列产生了较高数量的转化细菌菌落。
利用 NxT 的最佳技术进行转染 - Rhenium Bio
图 3. Neon NxT 重悬基因组编辑缓冲液在不同细胞类型和靶标的 CRISPR-Cas9 基因组编辑实验中的表现。靶标位点包括 Jurkat 和 K562 细胞的 ACTN、活化原代 T 细胞的 TRAC、HSC 的 B2M 和原代 NK 细胞的 AAVS1。细胞在 10 µL 或 100 µL 反应中进行电穿孔。(A) GFP 供体 DNA 敲入效率报告为 GFP 阳性细胞的百分比。(B) GFP 供体 DNA 敲入后的细胞活力。(C) 敲除效率报告为与未处理对照相比特定靶标位点的减少百分比。对于原代 NK 细胞，通过基因组切割检测 (GCD) 测定确定的插入/缺失效率 (%) 可作为敲除效率的指标。(D) 敲除细胞的电穿孔后活力。
Authenticase M0689 手册
在许多 DIY 基因合成工作流程中，用户通过购买合成的 dsDNA（例如 gBlocks）或制备重叠寡核苷酸的扩增子来获得用于组装的片段。通常，这些部分具有直接来自用于生成片段的寡核苷酸的残留错误。Authenticase 将减少/去除扩增子中源自寡核苷酸化学合成过程中插入错误的错配/插入/缺失区域。以下方案增加了酶校正 DNA 池中正确片段的数量，随后允许 DNA 聚合酶扩增以更准确和更高效地富集扩增子。校正和富集步骤的结合提高了组装基因合成的质量，从而产生了更多具有所需正确 DNA 序列的转化细菌菌落。
高效与CRISPR相关的蛋白9核糖核蛋白基于Euglena Gracilis
euglena gracilis是一种单细胞的光养生者，是一种有前途的食物，饲料和生物燃料的材料。但是，该物种中有针对性的诱变方法的发展一直是长期的挑战。在当前的遗传操纵技术中，通过RNP的直接递送进行基因组编辑具有各种优势，包括时间效率，低细胞毒性，高效率和降低距离效应（Jeon等，2017）。在我们的方法，插入和/或缺失（INDEL）突变率为77.7％–90.1％的突变率中，通过在Eggsl2基因中的两个不同靶序列中进行了扩增子测序（Nomura等，2019）。因此，我们在大肠杆菌中开发的基于RNP的基因组编辑开辟了新的途径以揭示基因的功能。
