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分析CRISPR介导的DNA裂解后基于NHEJ的DNA修复
摘要：使用CRISPR-CAS9核酸酶进行基因组编辑是基于DNA双重断裂（DSB）的修复。在真核细胞中，DSB通过同源指导的修复（HDR），非同源末端连接（NHEJ）或微学介导的终端连接（MMEJ）途径重新加入。其中，人们认为NHEJ途径是主导的，并且发生在整个细胞周期中。已知基于NHEJ的DSB维修是错误的；但是，很少有研究深入研究内源基因。在这里，我们通过掺入外源性DNA寡核苷酸来量化基于NHEJ的DSB修复精度（称为NHEJ精度）。通过对DSB发生后的外源性DNA和内源性靶点之间的连接序列的分析，我们确定NHEJ准确性的平均值在HEK 293T细胞中的最大值约为75％。在深入的分析中，我们发现NHEJ的精度依赖于序列，并且DSB端的近端邻近基序（PAM）的值相对较低，低于PAM远端的DSB。此外，我们观察到插入突变比与NHEJ准确性程度之间存在负相关。我们的发现将扩大对CAS9介导的基因组编辑的理解。
基因改造发育工程技术的历史与进展
摘要 使用改变目标基因组信息的技术进行靶向基因组修饰，已为基础生物学和应用生物学的多项研究做出了贡献。在基因打靶中，使用同源重组将打靶载体整合到靶位点。传统上，携带多个基因突变的小鼠是通过胚胎干细胞中的连续重组和耗时的单基因突变小鼠杂交产生的。然而，这种策略存在几个技术问题。第一个问题是基因打靶的频率极低，这使得获得重组克隆是一项极其耗费人力的任务。第二个问题是可以应用基因打靶的生物材料数量有限。传统的基因打靶几乎不会发生在大多数细胞系中。然而，一种使用设计核酸酶的新方法可以在基因组 DNA 中引入位点特异性双链断裂，提高了受精卵中基因打靶的效率。这种包括 CRISPR-Cas 系统的新方法也扩大了可以应用基因打靶的生物材料的数量。转基因的靶向整合可通过基于同源重组（HR）、微同源介导的末端连接（MMEJ）或非同源末端连接（NHEJ）的策略实现。本文，我们总结了靶基因修饰的各种策略，包括传统基因靶向与设计核酸酶的比较。
文章抑制 SHROOM1 可通过促进同源定向修复来改善体内和体外基因整合
摘要：同源重组 (HR) 常用于实现靶向基因整合，因为与微同源介导的末端连接 (MMEJ) 或非同源末端连接 (NHEJ) 相比，它具有更高的精度和可操作性。由于它只在细胞分裂期间发生，因此似乎对动物细胞和胚胎中的基因整合效率较低。在这里，我们开发了全基因组高通量筛选和随后的配对 crRNA 文库筛选，以寻找抑制同源定向修复 (HDR) 的基因。我们发现，在报告系统中，敲低 SHROOM1 的 HDR 细胞比对照细胞富集多达 4.7 倍。无论供体类型如何，下调 SHROOM1 均可显著促进人类和小鼠细胞中成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 核酸酶 (Cas9) 切割后的基因整合。通过在微注射过程中应用 SHROOM1 siRNA，小鼠胚胎的敲入效率也可以加倍。HEK293T 细胞中 SHROOM1 缺失引起的 HDR 效率增加可被 HDR 抑制剂 YU238259 抵消，但不能被 NHEJ 抑制剂抵消。这些结果表明 SHROOM1 是一个 HDR 抑制基因，SHROOM1 敲低策略可能适用于多种应用，包括基因编辑以生成用于研究基因功能和人类疾病的细胞系和动物模型。
二肽重复蛋白抑制 C9ORF72 ALS/FTD 中的同源性指导 DNA 双链断裂修复
方法和结果：使用 DNA DSB 修复分析，我们评估了特定修复途径的效率，发现 PR、GR 和 GA 降低了非同源末端连接 (NHEJ)、单链退火 (SSA) 和微同源介导的末端连接 (MMEJ) 的效率，但不降低同源重组 (HR)。我们发现 PR 部分通过与核仁蛋白核磷蛋白 (NPM1) 结合来抑制 DNA DSB 修复。NPM1 的消耗会抑制 NHEJ 和 SSA，这表明 PR 表达细胞中 NPM1 的功能丧失会导致非同源和同源定向 DNA DSB 修复途径受阻。通过删除 NPM1 亚细胞定位信号，我们发现 PR 会结合 NPM1，无论 NPM1 指向哪个细胞区室。删除已知可与其他富含精氨酸的蛋白质结合的 NPM1 酸性环基序可消除 PR 和 NPM1 结合。使用共聚焦和超分辨率免疫荧光显微镜，我们发现 RAD52（SSA 修复机制的一个组成部分）的水平相对于使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑删除了 C9ORF72 扩增的同源对照显著增加 iPSC 神经元。对死后脑组织的 Western 分析证实，与对照相比，C9ALS/FTD 样本中的 RAD52 免疫反应性显著增加。
表征有利于 Cas9 诱导的双链断裂处替代末端连接的序列背景
替代末端连接 (alt-EJ) 机制，例如聚合酶θ介导的末端连接，越来越多地被认为是导致双链断裂修复不准确的重要因素。我们之前提出了一个 alt-EJ 模型，其中双链断裂附近的短 DNA 重复退火形成二级结构，从而引发有限的 DNA 合成。然后，新生的 DNA 与另一个断裂端的微同源序列配对。这种合成依赖性微同源介导的末端连接 (SD-MMEJ) 解释了果蝇 I-SceI 核酸酶切割后恢复的许多 alt-EJ 修复产物。然而，影响 SD-MMEJ 修复的序列特异性因素仍有待充分表征。在这里，我们通过对 1100 种不同序列环境中 Cas9 诱导的双链断裂处的修复产物进行计算分析，扩展了 SD-MMEJ 模型的实用性。我们在单核苷酸分辨率下发现了成功修复 SD-MMEJ 的序列特征的证据。这些特征包括最佳引物重复长度、重复与断裂的距离、引物重复之间的 DNA 序列灵活性以及微同源模板相对于首选引物重复的定位。此外，我们还表明 DNA 聚合酶 theta 是 Cas9 断裂处大多数 SD-MMEJ 修复所必需的。本文描述的分析包括一个计算流程，可用于表征任何序列环境中 alt-EJ 修复的首选机制。
利用基因组编辑恢复视力的创新基因疗法
本次研究中，西口浩司副教授和中泽徹教授领导的研究小组建立了一种创新的基因治疗技术，使以前需要多个 AAV 才能进行的基因组编辑仅需一个 AAV 即可完成。当将该基因治疗技术应用于基因组编辑较为困难的神经系统疾病小鼠模型时，基因组编辑效率显著提高，并取得了较高的治疗效果。在这项新的基因治疗技术中，基因组编辑所需的组件已经被微型化，使得之前分离到两个 AAV 中的基因组编辑所需的组件可以合并到单个 AAV 中（图 1B）。 具体来说，通过利用微同源介导末端连接（MMEJ）作为基因组修复机制来插入正常序列，使用最少量的包含正常序列的DNA准确地修复基因组。当将这种 AAV 注射到患有完全失明视网膜变性的成年小鼠体内时，大约 10% 的致病突变得到正常化，光敏感度提高了 10,000 倍，视力恢复到正常值的约 60%（图 2）。此外，该疗法表现出与传统基因替代疗法相当的治疗效果，证明了这种新疗法的实用性。这一成果为基因疗法的发展铺平了道路，不仅针对以前无法治愈的视网膜色素变性，也针对许多其他遗传疾病。
化脓性链球菌 Cas9 核糖核蛋白递送，用于在锥虫和利什曼原虫中进行高效、快速和无标记的基因编辑
图 1 布氏锥虫 PCF 中的 GFP 失活。（a）对组成性表达胞浆 eGFP 的布氏锥虫进行荧光流式细胞术分析。在用 20 μ g（无 Cas9、Cas9/gRNA GFP1、Cas9/gRNA GFP2、Cas9/gRNA GFP3）或 60 μ g（Cas9/gRNA GFP2）来自 IDT 的 RNP 复合物转染后 24 至 72 小时随时间监测 GFP 荧光，条形图显示用不同向导转染后 72 小时 GFP 阴性细胞的百分比（n = 3）。采用 Prism 软件进行统计分析，采用 t 检验（非配对、正态分布、参数检验和双尾）。显着性水平（p 值）用星号表示。 （b）上图显示了允许 e Sp Cas9 在大肠杆菌中表达的质粒的示意图。蓝色框表示蛋白质 N 端和 C 端的两个多组氨酸序列，红色框表示 TEV 和肠激酶 (EK) 蛋白酶的切割位点，灰色框表示三个核定位信号 (NLS)，黑色框表示 FLAG 表位的三个重复，橙色框表示 e Sp Cas9 编码序列。下图显示了在用来自 IDT 或实验室纯化 (Lab) 的 RNPs 复合物 (无 Cas9、20 μ g Cas9/gRNA GFP2、40 μ g Cas9/gRNA GFP2、40、60 和 80 μ g Cas9/gRNA GFP2) 转染后 72 小时监测的表达 GFP 的 T. brucei 的荧光流式细胞术分析。（c）不再表达 GFP 的克隆中 GFP 基因的一部分的序列比较。该序列仅显示 GFP2 向导 RNA 所针对的区域。灰色框（H1 和 H2）突出显示可能用于 MMEJ 修复的同源区域。由实验室纯化的 Cas9 失活产生的序列和来自商业 Cas9 的序列分别标记为 Lab 和 IDT。下面显示了 Dc6 和 Ba10 克隆的相应色谱图（置信区间 95%— p 值样式：0.1234 (ns)；0.0332 (*)；0.0021 (**)；0.0002 (***)；< 0.0001 (****)）。