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World File Search SystemPEGRNA
顺序细胞事件的开放式分子记录到DNA
遗传编码的DNA记录器非侵入性地将短暂生物学事件转化为细胞基因组中持久的突变，从而可以使用高吞吐量DNA测序1重建细胞体验1。现有的DNA记录器已达到高信息记录2-15，耐用记录3,5–10,13,15-19，多个蜂窝信号的多重记录5-8,19,20以及时间分辨的信号记录记录为5-8,19,20，但在哺乳动物细胞中并非全部。我们提出了一个称为Pechyron的DNA记录器（通过有序插入的Prime编辑21个细胞历史记录记录）。在Pechyron中，哺乳动物细胞经过精心设计，以表达Prime编辑器和Prime编辑指南RNA 21（PEGRNA）的集合，可促进迭代式编辑的迭代回合。在每一轮编辑中，Prime编辑器与恒定的传播序列一起插入可变的三重态DNA序列，该序列会停用以前的序列并激活下一步的插入步骤。编辑可以无限期地继续进行，因为每个插入添加了启动下一步所需的完整序列。因为在任何给定时间只有一个主动目标位点，因此插入以单向顺序依次积累。因此，时间信息是按插入顺序保留的。通过使用只有单个DNA链的主要编辑器来实现耐用性，有效地避免了删除突变，这些突变可能会损坏存储在记录基因座中的信息。高信息含量是通过共表达各种PEGRNA（每个Pegrnas）来确定的，每个Pegrnas都具有独特的三个DNA序列。我们证明，这种PegrNA库的本构表达产生插入模式，以支持细胞谱系关系的直接重建。在替代的Pegrna表达方案中，我们还通过手动脉冲表达来实现多路复用记录，然后从Pechyron记录中重建脉冲序列。此外，我们将特定PEGRNA的表达耦合到特定的生物刺激，这允许哺乳动物细胞种群中化学暴露的暂时分析，多重记录。
改进的主要编辑允许在 Physcomitrium patens 中进行常规可预测的基因编辑
高效、精准的基因编辑是任何反向遗传学研究的黄金标准。最近开发的 Prime Editing 方法，即改进的 CRISPR/Cas9 [成簇的规律间隔的回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白] 编辑方法，已经达到了精度目标，但其编辑率还有待提高。我们提出了一种改进的方法，可在模型植物 Physcomitrium patens 中进行常规 Prime Editing，同时探索潜在的新 Prime Editing 改进。使用标准化的原生质体转染程序，通过直接植物选择评估了针对 APT 报告基因的多种 Prime Editing 向导 RNA (pegRNA) 结构和 Prime Editor 变体。综合起来，Prime Editor 表达的增强、pegRNA 3ʹ 延伸的修改以及在 pegRNA 的逆转录酶模板序列中添加同义突变，可显著提高编辑率，而不会影响编辑质量。此外，我们表明，prime editing 可以通过间接选择来编辑目标基因，正如 Ppdek10 突变体的产生所证明的那样。此外，我们确定植物逆转录转座子逆转录酶能够实现 prime editing。最后，我们首次展示了使用两个独立编码的肽进行 prime editing 的可能性。
用于 CRISPR 应用的 gRNA 和核糖核蛋白的表征
‒ 例如，(0.99) 99 = 37% 粗产量 ‒ 杂质更多，色谱分离更困难 ‒ pegRNA（基于 Cas9 sgRNA 进行主要编辑）甚至更长（~140 聚体）
利用机器学习预测不同编辑类型和染色质环境下的主要编辑效率
图 1 | 基于序列上下文的 pegRNA 效率表征和预测。（a）使用目标匹配的 pegRNA 文库“Library Diverse”进行筛选的示意图。（b - g）HEK293T 或 K562 中（b,c）插入、（d,e）HEK293T 或 K562 中 1-5bp 替换和（f,g）HEK293T 或 K562 中 1-15 bp 删除的编辑效率。（h,i）在 HEK293T（h）或 K562（i）细胞中安装了 2 个独立 1 bp 替换的双重编辑的编辑效率。预期编辑意味着安装了两个替换，而中间编辑意味着只安装了 2 个替换中的 1 个。距离 0 对应于单个 1 bp 编辑。 (j,k) 在 HEK293T (j) 和 K562 (k) 细胞中，在 GG PAM 序列内进行单 1bp 和双 1bp 替换（有或无编辑）的编辑效率。(d、e、hk) 条形图仅包含具有 7、10 或 15bp RTT 突出端的 pegRNA，以确保不同条件下 RTT 突出端分布相似。(bk) 条形图显示平均值，误差线表示平均值 +/- sem (l、m) PRIDICT2.0 在 Library-Diverse（5 倍交叉验证）上对 (l) HEK293T（n = 22,619）和 (m) K562（n = 22,752）细胞的性能。根据高斯 KDE，颜色渐变从深紫色到黄色表示点密度增加。 （n）PRIDICT2.0 示意图，该模型是基于两个模型的预测平均值的集成模型：（模型 A），
EGFR基因编辑通过CRISPR/CAS9和PRIME编辑EGFR基因编辑通过CRISPR/CAS9和PRIME编辑
将CRISPR/CAS9系统作为基因编辑工具的功能彻底改变了该领域，这是由于其易于设计和高灵敏度。CRISPR/CAS9系统有效地规避了先前基因编辑工具的局限性，并为基因组编辑的新时代铺平了道路。但是，更多的研究指出了CRISPR/CAS9自身的局限性。该技术的主要缺陷之一是脱靶效应的频率相对较高。为了克服这些障碍，最近已经开发了一种称为Prime Editing（PE）的第四代基因编辑工具。Prime编辑具有三个组成部分：Cas9 nickase，逆转录酶和Prime Editing Guide RNA（Pegrna）。PEGRNA可以进一步分解为间隔序列，支架，底漆结合位点和逆转录（RT）模板。RT模板已经包括可以通过逆转录酶转录的所需序列。这种新合成的DNA取代了原始链，提供了非常精确的编辑，而不是CRISPR/CAS9系统产生的随机插入/删除敲除。为此，我们进行了一系列研究，以比较CRISPR/CAS9系统和主要编辑的编辑效率。由CRISPR/CAS9系统敲除靶基因EGFR，已通过T7E1测定和质粒报告系统验证，这是强烈的绿色荧光信号所证明的。下一代测序已量化了Prime编辑的编辑率以及CRISPR/CAS9的编辑速率。ngs数据显示CRISPR/CAS9系统的高编辑频率，而未检测到Prime编辑的编辑。这种结果的可能原因之一是缺乏高通量实验来优化EGFR基因特异性的PEGRNA成分。
具有PAM灵活性的工程精选编辑
为了将PE2变体的活性与野生型PE2的活性进行比较，我们设计了PEGRNA，它可以针对35个基因组基因座NGN PAM。PEGRNA建议使用引物结合位点（PBS）和RT模板（13 NT PBS和11〜14 NT RT模板）的长度，并经过随机设计以在目标基因组基因座中安装插入，缺失和取代。我们使用单链DNA组装方法8（补充注释1）更有效地构造了PegrNA。使用这些PEGRNA，我们检查了HEK293T细胞中六种PE2变体和野生型PE2的主要编辑活性（图1A-C和补充表1）。正如预期的那样，野生型PE2主要在NGG PAM站点（在9个站点中的7个活性，在UBE3A-3+5G> C位点上活跃，高达23.8％，在NGA PAM站点上有一定的认可（在9个地点的4个地点，最高22.9％的ATC and cut）和公共ng> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> （在8个站点中的0个中活跃）或NGT位点（在9个站点中的0个位置活跃）。相反，PE2-NG，PE2-SPG和PE2-SPRY变体可以编辑NGN位点（PE2-NG：在34个站点中的24个，PE2-SPG中有效，PE2-SPG：在35个站点中的26个站点中活跃，PE2-SPRY，PE2-SPRY：活动中的24个站点中的24个站点中的24个站点）。与先前的研究6，PE2-NG变体相比，NGC PAM位点的活性相对较低，与NGD相比（其中D是A，G或T）PAM位点，并且与其他PE2变体相比，PE2-SPG变体在NGH处显示出最高的活性（其中H是A，C，C，T）PEAM位点（其中PE2）在其他PE2变体中（Fige2 variant）（FIGINIANT（FIGINIANT）（FIGINIANT（FIGINING）（FIGINIANT（FIGINID）（FIGINIANT（FIGINID）（FIGINIANT（FIGINID）（FIGINIANT（FIGINID）（图。1C和补充图1）。
Prime editor 整合酶系统促进靶向 DNA 插入及其他
转录模板和引物结合位点（图 1 A) [1]。无需诱导 DSB 和提供 DNA 供体，prime editing 是一种很有前途的精准基因组编辑技术。Prime edit 最初效率较低 [1]。令人鼓舞的是，通过共表达占主导地位的负错配修复 (MMR) 蛋白来抑制 MMR 去除 prime edit 的异源双链 DNA 产物 [2]，或通过使用具有多核苷酸替换 [3] 或减少 3′ 端降解 [4] 的 pegRNA，取得了改进。Prime edit 通过所有 12 个碱基替换和不同长度的删除，大大提高了基因组编辑能力 [1,5]。然而，一个挑战是使用 PE 插入超过 40 bp 的长 DNA，这部分是由于 pegRNA 3′延伸的长度限制和较长 RNA 的转录效率降低 [1]。为了克服目前 Prime Editing 对长 DNA 插入的限制，最近的两项研究报道了 Prime Editor 整合酶 (PEI) 系统，该系统无缝结合了 Prime Editing 和基于丝氨酸整合酶的重组 [ 6 , 7 ]。
Bi-PE：双向引发改善 CRISPR/Cas9 ...
由Cas9切口酶和逆转录酶组成的Prime Editor能够对小片段DNA进行精准的靶向编辑，包括所有12种碱基替换、插入和删除，而不需要双链断裂或供体模板。目前优化的Prime Editor策略（PE3）使用两条引导RNA来引导Prime Editor的性能。一条同时携带间隔区和模板序列的引导RNA（pegRNA）引导Prime Editor产生ssDNA断裂和随后的延伸，另一条引导RNA在互补链上产生切口。在这里，我们证明将切口sgRNA定位在pegRNA的模板序列附近可以促进靶向的大片段删除，并且将两条引导RNA改造成pegR-NA以实现双向Prime Editor（Bi-PE）进一步将效率提高了16倍，编辑产物的准确性提高了60倍。此外，我们还发现 Bi-PE 策略提高了多碱基同时转换的效率，但单碱基转换的效率不如 PE3。总之，Bi-PE 策略扩大了 Prime 编辑系统的编辑范围，提高了编辑效率和准确性，具有广泛的潜在应用价值。
开发高效的 prime editor 系统...
编辑效率不足在很大程度上限制了引物编辑系统在构建基因组编辑动物中的应用。本研究验证了 pegRNA 和 epegRNA 的 PBS Tm 对编辑效率的影响。发现最佳 Tm 为 42°C，且受培养温度的影响。然后，我们在 N2a 细胞中测试了各种提高引物编辑效率的策略，ePE3max 和 ePE5max 表现出显著提高编辑效率。然而，只有 ePE3max 在小鼠和兔胚胎中表现出相当高的编辑效率。我们的结果表明