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World File Search SystemPEGRNA
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2020年4月8日访问了Clinvar数据库。变体用以下条件过滤：1）包括有效的grch38/hg38坐标2）标记为“临床分解”列的致病性，3）包含一个由列的串联来确定的唯一标识符，由列的“名称”，“名称”，“ rs＃（dbsnp）”，“ rs＃（dbsnp）”和“ variatiationId”。所有具有模棱两可的IUPAC代码的变体都被转换为具有非模棱两可碱基的单独条目，用于下游分析。按照以下步骤，Clinvar变体的总数总计为69,481。序列输入均为所有条目的安装和校正这些病原变体的格式。在Clinvar变体上运行PrimedSign后，候选Pegrna Designs
基于 CRISPR 切口酶的软基因组编辑
摘要 Prime editor 在疾病建模和再生医学方面具有巨大潜力，包括针对肌肉萎缩症杜氏肌营养不良症 (DMD) 的研究。然而，Prime 编辑系统的庞大规模和多组分性质带来了巨大的生产和交付问题。本文，我们报告将优化的全长 Prime 编辑构建体包装在腺病毒载体颗粒 (AdVP) 中，可以在人类成肌细胞（即成肌细胞和间充质干细胞）中安装精确的 DMD 编辑（分别高达 80% 和 64%）。AdVP 转导确定了优化的 Prime 编辑试剂，这些试剂能够恢复约 14% 患者基因型的 DMD 阅读框架，并恢复未选择的 DMD 肌细胞群中的肌营养不良蛋白合成和肌营养不良蛋白-β-肌营养不良聚糖连接。 AdVP 同样适用于纠正 DMD iPSC 衍生的心肌细胞，并通过靶向外显子 51 缺失提供针对 DMD 修复的双引物编辑器。此外，通过利用不依赖细胞周期的 AdVP 转导过程，我们报告 2 组分和 3 组分引物编辑模式在细胞周期中最活跃，而不是在有丝分裂后细胞中。最后，我们确定将 AdVP 转导与无缝引物编辑相结合可以通过连续的递送轮次堆叠染色体编辑。总之，AdVP 允许对高级引物编辑系统进行多种研究，而不管其大小和组分数量如何，这应该有助于它们的筛选和应用。引言由序列定制的向导 RNA (gRNA) 和 Cas9 内切酶组成的可编程核酸酶是基因组编辑的有力工具。然而，双链 DNA 断裂 (DSB) 的普遍修复是通过容易出错的末端连接过程进行的，这赋予了基于核酸酶的基因组编辑内在的高诱变特性。相比之下，prime 编辑允许在特定基因组序列上安装任何单个碱基对变化和精确的小插入或删除 (indel)，而不会形成 DSB (1)。通常，prime 编辑复合物包含与切口 Cas9 变体 (prime editor) 融合的工程逆转录酶 (RT) 和 3' 端延伸的 gRNA，称为 prime 编辑向导 RNA (pegRNA)。pegRNA 分别通过其间隔物和 RT 模板部分指示靶位点选择和感兴趣的编辑。在靶位点切口后，释放的单链 DNA 与 pegRNA 的引物结合位点 (PBS) 退火，引发 RT 介导的 RNA 模板复制为互补 DNA，在基因组位点杂交、瓣切除和 DNA 修复或复制后，导致靶向染色体编辑 (1)。prime 编辑有两种主要模式，即 PE2 和 PE3 (1)。前者的 2 组分系统仅依赖于一个引物编辑蛋白（例如 PE2）和一个 pegRNA，而后者的 3 组分系统则需要一个补充的常规 gRNA。在 PE3 中，gRNA 引导的未编辑 DNA 链切口促使其被编辑链取代，这通常会导致同源双链 DNA 编辑频率更高，尽管同时增加了插入/缺失副产物 (1)。最近，基于将 prime editor 与双 pegRNA 一起递送的多重 prime 编辑正在进一步扩大 DSB 独立的基因组编辑程序的范围。事实上，在这种情况下，一对 prime 编辑复合物协同作用以安装基因组插入、删除和/或替换，其大小远远大于通过 PE2 和 PE3 策略实现的插入、删除和/或替换 (2-7)。由于其巨大的潜力和多功能性，prime 编辑系统正在快速发展，包括改进的 prime 编辑蛋白和 pegRNA，例如 PEmax (8) 和工程 pegRNA (epegRNA) 架构 (9,10)。PEmax 构建体在其 Cas9 切口酶和 RT 部分分别整合了特定突变和密码子优化，有助于增强 prime 编辑活性 (8)。 epegRNA 具有以结构化 RNA 假结形式延伸的 3' 端（例如 tevopreQ1），可保护它们免受核酸外切降解（9,10）。尽管取得了这些重要进展，但 Prime 编辑组件的庞大尺寸造成了严重的生产和交付瓶颈，阻碍了它们最有效的测试和应用。旨在改善交付瓶颈的方法包括将 Prime 编辑器构建体拆分为亚基，这些亚基在进入细胞后原位组装束缚或未束缚的 Cas9 切口酶和 RT 部分（11-20）。此外，其他辅助方法允许通过以下方式富集 Prime 编辑的细胞级分； (i) 使用替代报告基因或药物系统分离在靶基因和可选择标记基因上共同编辑的细胞 (21-23)，或 (ii) 通过共同递送细胞 DNA 错配修复途径的显性负因子来干扰编辑的 DNA 链去除 (8,10)。尽管适用于特定环境，但这些主要编辑系统的多组分特性使其设计复杂，并且其更广泛的应用具有挑战性。PEmax 构建体分别在其 Cas9 切口酶和 RT 部分中整合了特定突变和密码子优化，这有助于增强 prime editing 活性 (8)。epegRNA 具有以结构化 RNA 假结 (例如 tevopreQ1) 形式延伸的 3' 端，可保护它们免受核酸外切降解 (9,10)。尽管取得了这些重要进展，但是 prime editing 组件的尺寸较大，造成了严重的生产和交付瓶颈，阻碍了其最有效的测试和应用。旨在改善交付瓶颈的方法包括将 prime editor 构建体拆分为亚基，当进入细胞时，亚基就地组装束缚或不受束缚的 Cas9 切口酶和 RT 部分 (11-20)。此外，其他辅助方法允许通过以下方式富集 prime 编辑的细胞级分； (i) 使用替代报告基因或药物系统分离在靶基因和可选择标记基因上共同编辑的细胞 (21-23)，或 (ii) 通过共同递送细胞 DNA 错配修复途径的显性负因子来干扰编辑的 DNA 链去除 (8,10)。尽管适用于特定环境，但这些主要编辑系统的多组分特性使其设计复杂，并且其更广泛的应用具有挑战性。PEmax 构建体分别在其 Cas9 切口酶和 RT 部分中整合了特定突变和密码子优化，这有助于增强 prime editing 活性 (8)。epegRNA 具有以结构化 RNA 假结 (例如 tevopreQ1) 形式延伸的 3' 端，可保护它们免受核酸外切降解 (9,10)。尽管取得了这些重要进展，但是 prime editing 组件的尺寸较大，造成了严重的生产和交付瓶颈，阻碍了其最有效的测试和应用。旨在改善交付瓶颈的方法包括将 prime editor 构建体拆分为亚基，当进入细胞时，亚基就地组装束缚或不受束缚的 Cas9 切口酶和 RT 部分 (11-20)。此外，其他辅助方法允许通过以下方式富集 prime 编辑的细胞级分； (i) 使用替代报告基因或药物系统分离在靶基因和可选择标记基因上共同编辑的细胞 (21-23)，或 (ii) 通过共同递送细胞 DNA 错配修复途径的显性负因子来干扰编辑的 DNA 链去除 (8,10)。尽管适用于特定环境，但这些主要编辑系统的多组分特性使其设计复杂，并且其更广泛的应用具有挑战性。
利用 prime 编辑系统高效生成小鼠模型
亲爱的编辑，人类的大多数遗传疾病是由单核苷酸突变引起的。尽管使用基于 CRISPR 的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 1 或腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 2 进行基因组编辑对于某些遗传疾病中 C 到 T 和 A 到 G 碱基替换的基因校正大有希望 3,4，但这两种编辑器对于纠正其他变异（如碱基颠换、小插入和缺失 (indel)）均无效。prime editing 系统是一种“搜索和替换”基因组编辑技术，最近被添加到基因组编辑工具包 5 中。prime editors (PEs) 结合了外源性 CRISPR/Cas9 系统和内源性 DNA 修复系统，以实现更大的编辑多功能性，诱导 CBE 和 ABE（C → T、G → A、A → G 和 T → C）之外的所有类型的碱基到碱基转换、小插入/缺失及其组合。基因组编辑系统从PE1进化到PE3（PE3b），效率逐步提高5。PE1的执行器由工程化的Cas9切口酶与逆转录酶（M-MLV RTase）5融合构建，可靶向基因组位点，切口DNA并引发逆转录（RT）。执行器结合工程化的基因组编辑向导RNA（pegRNA）寻找并切口目标DNA，从而通过RT将新的遗传信息编码到基因组中。然后，对M-MLV RTase引入突变以提高PE1的编辑效率，此PE2被称为PE2。随后，在PE3b中，执行器与工程化的Cas9切口酶5融合，可靶向基因组位点，切口DNA并引发逆转录（RT）。执行器与工程化的基因组编辑向导RNA（pegRNA）结合，寻找并切口目标DNA，从而通过RT将新的遗传信息编码到基因组中。然后，对M-MLV RTase引入突变以提高PE1的编辑效率，此PE2被称为PE2。
引导编辑系统研究进展
flap 之间存在动态转换，使所需 DNA 信息有机会 与基因组的靶标链结合，之后 5' flap 会在细胞修复 的过程中被切除，经过 DNA 修复过程，最终实现基 因组信息的修改 ( 图 1 ) 。在这个过程中，融合蛋白 承担了切割目标位点非靶标链和逆转录的双重功 能，而 pegRNA 既引导 PE 识别目标位点，又包含了编辑 所需的信息。通过这 2 个组分， PE 系统实现了识 别、切割、起始逆转录的引物序列结合、逆转录等一 系列过程，并将所需 DNA 信息直接逆转录至目标 位点的断裂处 [ 26 ] 。 PE 系统的设计非常简单精巧，无 需引入 DNA 模板，也不产生双链断裂，是一种非常
垂直农业：从基因改造到环境改造
该系统具有通用性，为以有用的效率引入点突变和小插入/缺失提供了几乎无限的可能性，而无需共同传递修复模板。该系统的进一步改进应侧重于提高主要编辑效率，主要通过测试不同的 RT 和 pegRNA 设计。为了克服编辑窗口的限制，使用具有不同 PAM 要求的不同 Cas 蛋白将允许将复合物带到正确的位置以引入所需的修改。此外，需要详细分析该技术在植物中的特异性，并与其他可用的植物基因组修饰方法在脱靶编辑方面进行比较分析。最后，为了提高主要编辑技术的多功能性，有必要改进引入的插入/缺失的大小并减少编辑副产物。
肽融合提高主要编辑效率 1
Prime editing 是一种基于 CRISPR 的“搜索和替换”技术，可在没有双链断裂 (DSB) 或供体 DNA 模板 1 的情况下，在哺乳动物细胞中介导靶向 32 插入、删除和所有可能的碱基对碱基转换。Prime editing 34 酶 (PE2) 由与工程逆转录酶 (RT) 融合的 SpCas9 切口酶组成。35 PE2 通过 Prime editing 向导 RNA (pegRNA) 被招募到目标位点，该 RNA 除了标准基因组靶向间隔区和 SpCas9 结合发夹结构外，还包含 3' 序列，37 该序列充当融合 RT 的模板，以在一条切口 DNA 链上合成编程的 DNA 序列。当细胞 DNA 修复机制修复断裂的链时，这种 RT-39 延伸片段会与未编辑的片段竞争，而编辑后的序列有时会取代基因组中的原始序列 1,2。41
基于 CRISPR 切口酶的软基因组编辑
摘要 Prime editing 是一种近期出现的精确基因组编辑方式，其多功能性为包括靶向基因疗法开发在内的广泛应用提供了前景。然而，其优化和使用的一个突出瓶颈是难以将大型 prime 编辑复合物递送到细胞中。在这里，我们证明将 prime 编辑构建体包装在腺病毒衣壳中可以克服这一限制，从而在转化和非转化的人类细胞中实现强大的基因组编辑，效率高达 90%。使用这种不依赖细胞周期的递送平台，我们发现 prime 编辑活动与细胞复制之间存在直接相关性，并揭示了准确的 prime 编辑事件与不需要的副产物之间的比例可能受靶细胞环境的影响。因此，腺病毒载体颗粒允许在人类细胞中有效地递送和测试 prime 编辑试剂，而与它们的转化和复制状态无关。本文整合的基因传递和基因编辑技术有望帮助研究在众多实验环境中以及最终在体外或体内治疗环境中进行主要编辑的潜力和局限性。简介基于序列可定制的向导 RNA (gRNA) 和 CRISPR 相关 (Cas) 核酸酶的可编程核酸酶是强大的基因组编辑工具 (1,2)。然而，除了脱靶诱变 (3-9) 之外，可编程核酸酶通常会因非法重组过程修复双链断裂 (DSB) 而产生复杂的靶等位基因破坏和大规模基因组重排 (10,11)。因此，最近的基因组编辑发展包括从 DNA 切割发展到基于切口 Cas 蛋白本身 (12–14) 的 DNA 非切割技术，或基于这些与 DNA 修饰部分融合的 RNA 可编程切口酶，例如碱基编辑器和最近的 prime editors (15,16)。Prime 编辑允许安装任何单个碱基对替换以及明确定义的小插入或删除，同时不需要 DSB 或供体 DNA 底物 (15)。Prime editors 由扩展的 gRNA 和 Cas9 H840A 切口酶组成，它们与工程逆转录酶 (RT) 融合，分别命名为 pegRNA 和 PE2 (补充图 S1A)。pegRNA 由 3' 端共价连接到编码目标编辑的 RT 模板和 RT 引物结合位点 (PBS) 的 gRNA 形成。位点特异性基因组 DNA 切口产生 3' 端 DNA 瓣，经 PBS 退火后，在 RNA 模板上引发 RT 介导的 DNA 合成。PE2 和 PE3。DNA 拷贝杂交至互补靶 DNA 后，编辑最终通过连续链解析反应整合到基因组中（补充图 S1B）。Prime 编辑有两种主要方式，即前者系统需要传递 PE2：pegRNA 复合物；后者依赖于这些复合物与传统 gRNA 一起转移。在 PE3 系统中，gRNA 指导的未编辑 DNA 链切口促进了使用编辑链作为修复模板（补充图 S1B）。尽管 Prime 编辑原理具有巨大的潜力和多功能性，但仍存在一些需要识别、仔细评估和解决的特定缺陷。大型的 Prime 编辑核糖核蛋白复合物由 ∼ 125 个核苷酸长的 pegRNA 和由 6.3 kb ORF 编码的 238 kDa 融合蛋白组成，这带来了巨大的生产和交付问题。事实上，生产足够数量的 >100 kDa 蛋白质尤其具有挑战性。此外，尽管病毒载体是最有效的基因组编辑工具递送系统之一 (17)，但最常用的平台基于 ∼ 15 nm 腺相关病毒 (AAV) 颗粒，由于其包装容量有限（∼ 4.7 kb）（17），不适合转移全长 Prime 编辑序列。完全病毒基因删除的腺病毒载体（也称为高容量腺病毒载体），以下称为腺载体颗粒 (AdVP)，聚集了一组有价值的特征，即； (i) 大包装容量（即高达 36 kb），(ii) 严格的游离性，(iii) 高遗传稳定性；(iv) 容易的细胞趋向性改变和 (v) 高效转导分裂和静止细胞 (17–21)。在这里，我们研究了定制这些 ∼ 90 nm 生物纳米粒子用于全长主要编辑组件的一次性转移的可行性和实用性，并且由于潜在或影响主要编辑结果的细胞过程基本上是未知的，利用后一个特性来研究细胞周期对这种位点特异性 DNA 修饰原理的作用。材料和方法 细胞
植物引物编辑器实现水稻细胞的精准基因编辑
基因组编辑正在彻底改变植物研究和作物育种。序列特异性核酸酶 (SSN)，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和 TAL 效应核酸酶 (TALEN)，已用于产生位点特异性 DNA 双链断裂并通过促进同源定向修复 (HDR) 实现精确的 DNA 修饰 (Steinert 等人，2016 年；Voytas，2013 年)。后来，RNA 引导的 SSN，例如 CRISPR-Cas9、Cas12a、Cas12b 及其变体，已应用于植物基因组编辑 (Li 等人，2013 年；Nekrasov 等人，2013 年；Tang 等人，2017 年；Zhong 等人，2019 年；Ming 等人，2020 年；Tang 等人，2019 年)。然而，HDR 依赖于 SSN 和 DNA 供体的同时递送，这在植物中一直具有挑战性（ Steinert 等，2016； Zhang 等，2019）。在植物中实现高效 HDR 的另一个挑战是，在大多数细胞类型中，DNA 修复倾向于非同源末端连接（NHEJ）途径而不是 HDR（ Puchta，2005； Qi 等，2013）。与受供体选择和 DNA 修复机制限制的 SSN 诱导的 HDR 不同，近年来开发的胞苷或腺嘌呤碱基编辑器可以在原型间隔物中 3-8 个核苷酸靶向窗口内将 C 转换为 T 或将 A 转换为 G（ Komor 等，2016； Nishida 等，2016； Gaudelli 等，2017）。碱基编辑器虽然效率很高，但只能指导某些转换突变，而不能执行预定的颠换突变或插入和缺失 (indel)。在所有这些背景下，最近在人类细胞中开发所谓的引物编辑器 (PE) 方面取得的突破非常令人兴奋 ( Anzalone 等人，2019 )。在引物编辑中，Cas9H840A 切口酶与逆转录酶融合。融合蛋白在编辑 DNA 链上切口，通过引导到切口 DNA 并复制由引物编辑向导 RNA (pegRNA) 编码的遗传信息来启动逆转录。多功能的 pegRNA 是一种经过修饰的单向导 RNA (sgRNA)，其 3' 端携带逆转录 (RT) 模板和引物结合位点 (PBS) 或序列中的引物。与 HDR 不同，PE 不需要 DNA 供体。在某些目标位点，PE 似乎也比碱基编辑器更精确、更高效（Anzalone 等人，2019 年）。
piggyPrime：人类细胞中的高效 Prime 编辑......
基于 CRISPR-Cas9 系统的 Prime Editing（Jinek 等人，2012 年；Jinek 等人，2013 年；Ran 等人，2013 年）通过支持有针对性的插入、删除或 12 种可能的单碱基替换中的任何一种，实现基因组的精确编辑。通过 Prime Editing 进行的基因编辑既不涉及供体模板，也不涉及双链断裂（Anzalone 等人，2019 年）。Prime Editing 的这些独特属性基于 Prime Editor (PE) 的传递，该 Prime Editor 由 Cas9-逆转录酶融合蛋白（以下称为 PE2）以及 Prime Editing 向导 RNA（pegRNA）组成，后者指定基因组靶标以及要直接写入基因组的所需编辑。 Prime 编辑在治疗致病突变以及生成疾病模型（体外和体内）方面具有巨大潜力（Schene 等人，2020 年；Jang 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Liu 等人，2021 年；Park 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年；Qian 等人，2021 年）。然而，目前 Prime 编辑的使用受到低效率的挑战，导致需要耗费大量的优化和/或筛选方法才能实现令人满意的编辑效果（Liu 等人，2020 年；Schene 等人，2020 年；Chemello 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年）。将编码传统 CRISPR 效应物（如 Cas9 和单向导 RNA）的基因盒稳定整合到哺乳动物细胞基因组中，已广泛应用于生命科学研究，包括用于生成模型细胞系和 CRISPR 筛选（Shalem 等人，2014 年；Holmgaard 等人，2017 年；Thomsen 等人，2020 年）。对于主要编辑，由于 PE2 编码序列较大（6351 bp），因此难以将 PE2 表达盒有效整合到哺乳动物细胞基因组中。由于包装能力有限，这使病毒载体的使用变得困难（Kumar 等人，2001 年），到目前为止，PE2 系统仅通过使用两个独立的慢病毒载体递送内含肽分裂 PE2 盒而整合到哺乳动物细胞基因组中（Anzalone 等人，2019 年）。这里我们介绍了 piggyPrime，这是一种非病毒单载体系统，可利用 piggyBac 转座子系统的强大整合能力，轻松高效地将所有主要编辑组件整合到人类细胞中。重要的是，DNA 转座促进的 PE2 和 pegRNA 的长期表达支持提高主要编辑水平，从而为有效转基因提供了一种新方法。
利用DSB维修以促进有效的同源性...
Prime编辑最近作为用于精确基因组编辑的下一代方法。在这里，我们利用DNA双链断裂（DSB）修复来开发两种新型策略，这些策略使用基于SP Cas9核酸酶的Prime Editor（PEN）安装精确的基因组插入。我们首先证明，与常规的Prime编辑指南RNA（PEGRNA）相连，可以有效地通过依赖同源性的DSB修复机制促进短基因组插入。虽然笔编辑导致副产品的水平增加，但它挽救了与基于Nickase的Prime编辑器表现不佳的Pegrnas。我们还提出了一种小分子方法，该方法产生了笔编辑的产物纯度。接下来，我们通过设计一个单个启动插入GRNA（springRNA）来开发同源性独立笔编辑策略，该插入式插入式插入（SpringRNA）通过非同源端连接途径（NHEJ）安装DSB的基因组插入。最后，我们表明，在DSB上进行的笔介导的插入阻止了Cas9诱导的大染色体缺失，并提供了证据表明连续CAS9介导的切割是Cas9诱导的大缺失的一种机制之一。总的来说，这项工作通过利用包括NHEJ在内的不同的DNA修复机制来扩展当前的Prime编辑工具箱，NHEJ代表了哺乳动物细胞中DSB修复的主要途径。