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与长期水族馆设施中的热带八放珊瑚相关的四种新型 Endozioicomonas 菌株的基因组序列
我们报告了从葡萄牙里斯本海洋馆 19 立方米热带展览水族馆中保存的两个 Litophy ton sp. 标本中分离出的四种 Endozoicomonas 菌株的基因组。如前所述 (2) 回收宿主衍生的微生物细胞悬浮液。将一克珊瑚组织在 9 mL 无菌 Ca 2+ - 和 Mg 2+ - 人工海水中均质化 (2)。将匀浆连续稀释，分别接种在 1:2 稀释的海洋琼脂和 1:10 稀释的 R2A 培养基上，并在 21°C 下孵育 4 周。使用 Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒 (Promega, USA) 从 1:2 海洋肉汤中新鲜生长的培养物中提取单个菌落的基因组 DNA。使用通用引物 (F27 和 R1492) 从基因组 DNA 中扩增 16S rRNA 基因，通过 Sanger 测序来确认纯度。使用 SILVA 比对、分类和树服务 (v1.2.12) 和数据库 (v138.1) 进行分类分配。使用 PacBio 测序技术 (5)，相同的基因组 DNA 样本在 DOE 联合基因组研究所 (JGI) 进行基因组测序。对于每个样本，将基因组 DNA 剪切至 6-10 kb，使用 SMRTbell Express Template Prep Kit 3.0 进行处理，并用 SMRTbell 清理珠 (PacBio) 进行纯化。使用条形码扩增寡核苷酸 (IDT) 和 SMRTbell gDNA 样本扩增试剂盒 (PacBio) 富集纯化产物。构建了 10 kb PacBio SMRTbell 文库，并使用 HiFi 化学在 PacBio Revio 系统上进行测序。使用 BBTools v.38.86 ( http://bbtools.jgi.doe.gov ) 根据 JGI 标准操作规范 (SOP) 协议 1061 对原始读段进行质量过滤。使用 Flye v2.8.3 (6) 组装过滤后的 >5 kb 读段。生物体和项目元数据存放在 Genomes OnLine 数据库中 (7)。使用 NCBI 原核基因组注释流程 (PGAP v.6.7) (8) 和 DOE-JGI 微生物基因组注释流程 (MGAP v.4) (9) 对重叠群进行注释，并与集成微生物基因组和微生物组系统 v7 (IMG/M) 相结合进行比较分析 (10)。使用 CheckM 评估基因组完整性和污染
与长期水族馆设施中的热带八放珊瑚相关的四种新型 Endozioicomonas 菌株的基因组序列
我们报告了从葡萄牙里斯本海洋馆 19 立方米热带展览水族馆中保存的两个 Litophy ton sp. 标本中分离出的四种 Endozoicomonas 菌株的基因组。如前所述 (2) 回收宿主衍生的微生物细胞悬浮液。将一克珊瑚组织在 9 mL 无菌 Ca 2+ - 和 Mg 2+ - 人工海水中均质化 (2)。将匀浆连续稀释，分别接种在 1:2 稀释的海洋琼脂和 1:10 稀释的 R2A 培养基上，并在 21°C 下孵育 4 周。使用 Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒 (Promega, USA) 从 1:2 海洋肉汤中新鲜生长的培养物中提取单个菌落的基因组 DNA。使用通用引物 (F27 和 R1492) 从基因组 DNA 中扩增 16S rRNA 基因，通过 Sanger 测序来确认纯度。使用 SILVA 比对、分类和树服务 (v1.2.12) 和数据库 (v138.1) 进行分类分配。使用 PacBio 测序技术 (5)，相同的基因组 DNA 样本在 DOE 联合基因组研究所 (JGI) 进行基因组测序。对于每个样本，将基因组 DNA 剪切至 6-10 kb，使用 SMRTbell Express Template Prep Kit 3.0 进行处理，并用 SMRTbell 清理珠 (PacBio) 进行纯化。使用条形码扩增寡核苷酸 (IDT) 和 SMRTbell gDNA 样本扩增试剂盒 (PacBio) 富集纯化产物。构建了 10 kb PacBio SMRTbell 文库，并使用 HiFi 化学在 PacBio Revio 系统上进行测序。使用 BBTools v.38.86 ( http://bbtools.jgi.doe.gov ) 根据 JGI 标准操作规范 (SOP) 协议 1061 对原始读段进行质量过滤。使用 Flye v2.8.3 (6) 组装过滤后的 >5 kb 读段。生物体和项目元数据存放在 Genomes OnLine 数据库中 (7)。使用 NCBI 原核基因组注释流程 (PGAP v.6.7) (8) 和 DOE-JGI 微生物基因组注释流程 (MGAP v.4) (9) 对重叠群进行注释，并与集成微生物基因组和微生物组系统 v7 (IMG/M) 相结合进行比较分析 (10)。使用 CheckM 评估基因组完整性和污染
Kinnex全长RNA试剂盒，用于同工型测序
PACBIO RNA测序已被证明提供了最长的读取长度和同工型发现和同工型定量所需的最高质量读取（Pardo-Palacios等，2024）。KINNEX™全长RNA试剂盒采用由ISO-SEQ Express 2.0套件产生的全长cDNA作为输入，并输出一个可进行测序的库，该库与典型的ISO-SEQ库相比导致8倍吞吐量增加。与SMRT®链接软件中的读取细分和ISO-SEQ分析相结合，PACBIO提供了不需要正交测序方法的具有成本效益的同工型测序。SMRT链接软件生产具有大量信息的同工型分类报告，该报告可通过三级分析工具使用。
来自Ash Yellows Group
“ Cantidatus Phytoplasma Fraxini”的Ashy1菌株起源于伊萨卡（美国纽约，美国纽约），并于白灰（Fraxinus Americana），并被转移到Catharanthus Roseus（5）。使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）制备了由感染的玫瑰花芽芽孢杆菌和叶子材料制备的测序模板。使用SMRTBELL PREP KIT 3.0（美国加利福尼亚州PACBIO）的SMRTBELL PREP KIT 3.0（美国）而没有其他DNA片段化制备了用于单分子实时（SMRT）的高保真库。在Max Planck Genome-Centre（德国科隆）的续集IIE设备（PACBIO）上对片段文库进行了测序，其结合KIT 2.0（PACBIO）和续集II测序套件2.0（PACBIO）。通过使用BLAST+ v2.2.2.9，MetAgenome Analyze（Megan）和一个数据核定的数据，通过BLAST+ v2.2.2.9，MetAgenome Analyze（Megan）v.6.18.2（6.18.2（6.18.2）（6）（6）（6.6.18.2（6）的候选，分类构造分类为“ candidatus phyto plasma”属，其中11,518个读取（5834中的N 50）被分配给“念珠菌Phyto等离子体”属。 GenBank的Tus Phytoplasma”和Catharanthus Roseus（登记：2024年1月）。 使用PACBIO-HIFI选项和估计的基因组大小为600 kb，将其余的读数与CANU v2.2（7）组装在一起。 实现了一个连续的圆形序列，具有67.17倍的覆盖率。 通过爆炸分析确认了> 10 kb的序列重叠。 随后，使用Artemis V18.2.0（8）手动删除序列重叠。 在Rast V2.0（9）中进行了完整染色体的注释，然后在Artemis v18.2.0（8）中进行手动策划，DNAA将DNAA设置为染色体的第一个基因。 未发现质粒。通过BLAST+ v2.2.2.9，MetAgenome Analyze（Megan）v.6.18.2（6.18.2（6.18.2）（6）（6）（6.6.18.2（6）的候选，分类构造分类为“ candidatus phyto plasma”属，其中11,518个读取（5834中的N 50）被分配给“念珠菌Phyto等离子体”属。 GenBank的Tus Phytoplasma”和Catharanthus Roseus（登记：2024年1月）。使用PACBIO-HIFI选项和估计的基因组大小为600 kb，将其余的读数与CANU v2.2（7）组装在一起。实现了一个连续的圆形序列，具有67.17倍的覆盖率。通过爆炸分析确认了> 10 kb的序列重叠。随后，使用Artemis V18.2.0（8）手动删除序列重叠。在Rast V2.0（9）中进行了完整染色体的注释，然后在Artemis v18.2.0（8）中进行手动策划，DNAA将DNAA设置为染色体的第一个基因。未发现质粒。使用BUSCO的151个单拷贝直系同源物（94％）的比较支持了注释的完整性（10）。在染色体组装中未考虑的读数对额外的分类套筒进行了进一步的分类，并筛选了ASHY1的肉体外DNA。默认参数用于所有软件，除非另有说明。
测序所需的设备和材料
PACBIO强烈建议使用汉密尔顿液体处理系统将DNA剪切至〜15 - 20 kb的片段尺寸范围，用于WGS样品制备工作流程。If a Hamilton system is unavailable, a Megaruptor 3 system, Spex SamplePrep 1600 MiniG homogenizer or MP Bio FastPrep 96 homogenizer may also be used to shear DNA samples.如果上述剪切工具都不可用，则Covaris g-tube提出了一种替代剪切方法，该方法不需要仪器以外的标准微分离散 - 参见技术注：Covaris G-Tube DNA剪切smrtbell Prep Kit 3.0（102-326-501），以获取更多信息。有关特定设备建议的更详细的指导，请参阅适当的PACBIO程序和清单。
评估16S-ITS-23S操纵子测序的效率
使用0.01％的相对丰度截止的应用导致大多数物种级分类方法的提高F1得分（图。3a.i）。值得注意的是，在ATCC模拟社区的情况下，四种MM方法中的三种，MM_Fangorn-G，MM_Fangorn-R和MM_MIRROR在ONT和PACBIO数据集中均显示出大幅度的F1分数。但是，对于MCAP和MCGD社区，仅在ONT数据集中观察到这一显着增加。专门应用于PACBIO数据的QB方法在ATCC社区的所有五个相对丰度截止值中保持了一致的F1分数。但是，对于MCAP和MCGD社区的相同方法最初在NO（0％）和0.001％的截止值下表现出一致的F1分数，随后逐渐下降了0.001％的临界值。通常，在三个模拟社区中，相对丰度截止的实施没有
应用注释 - puretarget重复扩展面板和HIFI测序的全面基因分型
自定义Puretarget面板没有PACBIO正式支持。用户必须设计和订购其指南RNA并相应地优化其自定义面板。PACBIO可以提供有关指南RNA设计软件和优化自定义面板的策略的有限指导。我们建议在添加新的指南RNA或测试一组自定义指南之前，请首先使用支持的样本类型在Puretarget重复扩展面板上进行成功。添加少量重复扩展目标是相对较低的风险，因为片段的大小与套件（4-5 kb）中提供的面板相似。已显示出多达5对指南的成功，以实现其他重复扩展目标。SMRT链接PuretArget重复扩展分析或带有TRGT的命令行分析可以与包括新坐标的更新目标床文件一起使用。
RSC Advances
其中，单分子测序（SMS）代表了第三代测序技术的变革性飞跃。与传统的短阅读测序方法不同，SMS可以直接对10 kbp或更长的单个DNA分子进行直接测序，而无需PCR扩展，从而在基因组学研究中具有前所未有的优势。这项技术提供了长长的读取长度，高精度和统一的基因组覆盖范围，使其广泛适用于检测基因组结构变体，高度重复的区域和临床诊断。5 - 7个平台，例如PACI的单分子实时（SMRT）测序（PACBIO）（PACBIO）和牛津纳米孔技术（ONT）的纳米孔测序，已经证明了SMS在基因组组装到临床诊断和个性化药物中的不同应用中的潜力。8,9完成
评估基因组组装的策略......
商标：QIAGEN ® 、Sample to Insight ® (QIAGEN Group)；Oxford Nanopore ® (Oxford Nanopore Technologies)；PacBio ® (Pacific Biosciences of California, Inc.)。本文件中使用的注册名称、商标等，即使未明确标记，也不得视为不受法律保护。