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用脱氨酶替换 SpCas9 HNH 结构域可生成具有替代靶向范围的紧凑型碱基编辑器
碱基编辑器是 RNA 引导的脱氨酶，可实现位点特异性核苷酸转换。这些 Cas 脱氨酶融合蛋白的靶向范围主要取决于靶基因座处原间隔区相邻基序 (PAM) 的可用性，并且仅限于 CRISPR-Cas R 环内的窗口，其中单链 DNA (ssDNA) 可供脱氨酶接触。在这里，我们推断 Cas9-HNH 核酸酶结构域在空间上限制了 ssDNA 的可及性，并证明省略该结构域会扩大编辑窗口。通过将 HNH 核酸酶结构域与单体或异二聚体腺苷脱氨酶交换，我们还设计了具有 PAM 近端移位编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器变体 (HNHx-ABE)。这项工作扩展了碱基编辑器的靶向范围，并提供了明显更小的碱基编辑器变体。此外，它还提供了 Cas9 蛋白质工程的未来潜在方向，其中 HNH 结构域可以被作用于 ssDNA 的其他酶取代。
富集
Illumina无细胞的DNA准备富集是一种基于连接的测定法，该测定法使用单个杂交步骤进行快速文库制备（图2）。富集的无细胞DNA制备与来自Illumina的用户富集寡核苷酸兼容。使用来自Illumina的免费在线DesignStudio™工具，基于您指定的目标基因列表的来源自定义丰富面板。Dive designStudio工具与单链DNA（ssDNA）富集探针和双链DNA（DSDNA）富集V2探针兼容。为了增强内容可移植性，可以将无细胞的DNA准备富集与综合DNA技术和Twist Bioscience的DSDNA探针一起使用。该套件可容纳55-2000 kb ssDNA和70-2000 kb dsdna面板含量，从而实现灵活的研究设计。在〜8.5–9.5小时内准备好的测序库，只有〜2.5–3小时的动手时间，使研究人员可以在一天内从提取的CFDNA转变为测序。为了最大程度地效率和灵活性，该试剂盒与使用基于市售柱或珠的纯化方法直接从外周血或等离子体中提取的CFDNA兼容。
AccuBlue® 宽范围 RNA 定量试剂盒
该试剂盒非常适合定量 RNA，用于下一代测序 (NGS) 或逆转录 PCR (RT-PCR) 等敏感应用。与基于吸光度的测量不同，RNA Broad Range Dye 对 RNA 的选择性高于双链 DNA (dsDNA)，并且可以耐受样品中等摩尔量的 dsDNA，而不会对 RNA 定量产生显著影响（图 4）。仍然建议使用纯化的 RNA 样品。该测定还可用于定量小 RNA，例如 miRNA（图 5）以及单链 DNA (ssDNA)，尽管与 RNA 相比，ssDNA 发出的荧光信号较低（图 6）。与总 RNA 相比，该测定对 dsRNA 发出的信号非常低（图 7）。
改进单链 DNA 病毒的测序
Malathi VG、Renuka Devi P. (2019) SsDNA 病毒：全球病毒组中的关键参与者。病毒性疾病。 30：3–12。 https://doi.org/10.1007/s13337-019-00519-4
利用分支间隔物和点击化学在 DNA 生物传感器表面实现高杂交密度
过去十年，DNA 生物传感器的发展加速，尤其用于医学诊断、癌症研究和基因表达分析。1 最近的 COVID-19 大流行强调了开发灵敏可靠的病毒检测技术的必要性。与其他类型的 DNA 生物传感器相比，基于表面的 DNA 生物传感器具有许多优势，例如高灵敏度和价格实惠。2 它们还可以应用于微流体系统中以进行自动检测。3 这些传感器依赖于将单链 DNA (ssDNA) 探针固定在固体基质上，这些探针能够与其互补的 DNA 或 RNA 靶序列杂交。其中，固定在表面的 ssDNA 探针的探针密度和杂交效率是决定生物传感装置性能的关键参数。3,4
CRISPR 敲入方案
注意：确保将 Cas9 蛋白作为反应中的最后一种材料添加。在 KO 实验中，无需添加 HDRT。表中 Cas9 与 sgRNA 的比例为 1:3，对于 1.8kb ssDNA，HDRT 为 4 μ g。强烈建议针对每个具体设计对 Cas9：sgRNA 比例以及 Cas9 蛋白和 HDRT 的量进行实验优化。GenScript 建议通过测试 1:1 和 1:4 之间的 RNP 比例开始优化。我们建议 ssDNA 的量可以设置在 2 μ g 和 6 μ g 之间（对于 0.5kb 和 4kb 之间的 HDRT 长度；如果 HDRT 长度超出此范围，则可能需要适当调整试剂的量）。最好为第一次实验分别设置阴性对照、阳性对照和转染对照。
用于基因校正和基因插入的非病毒单链 DNA 模板的环化可改善 HSPC 中的编辑结果
利用 TALEN® 技术，我们开发了一种基因编辑过程，通过同源性定向修复在造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中实现高效的基因校正和基因插入。我们首先评估了非病毒线性单链 DNA (LssDNA) 供体模板递送策略与更常用的病毒 (AAV) 递送的潜力。这两种策略均导致基因在体外插入 HSPC。然后，我们比较了 LssDNA 与环化单链 DNA (CssDNA) 的使用情况。我们发现环化显著提高了敲入 (KI) 效率，相对于其线性对应物。有趣的是，KI 的这种增加分别与环状和线性 ssDNA 编辑细胞中更高的存活率和更低的敲除 (KO) 相关。总体而言，我们表明，与 TALEN® 基因编辑相关的非病毒 ssDNA 传递可在长期重新植入的造血干细胞中实现高水平的基因校正。ssDNA 的环化有可能进一步提高 KI 的速率，而不会影响细胞活力和适应性，从而促进下一代细胞疗法的发展。
DNA接枝磁性纳米颗粒的合作动力学优化磁性生物传感和耦合到DNA折纸
AFM显微照片（图S1）。D H分布记录在分散在Tris-Edta（TE）缓冲液中的CMP上的Malvern-Zetasizer-Nano仪器上（5 mM Tris，1 mm EDTA，1 mm EDTA，5 mm NaCl，pH 7.3）。（d）菌株促进的叠氮化物 - 烷基环加成（SPAAC）的方案 - 铜铜的铜线自由点击反应在叠氮化物标记的CMPS和二苯并杂志环链（DBCO） - 修饰的ssDNA低聚物之间。（e）根据耗尽测定估计的平均值（SEM）标准误差的平均ssDNA数量与标称移植密度r（x）相比。（f）在90 MA处的0.5％琼脂糖凝胶上，在不同的R（x）值上对CMP和CMP-DNA偶联物进行的琼脂糖凝胶电泳移位测定，P代表装载口袋。（g）CMP-DNA的凝胶相对前（r f）相对于r（0）样品的r f，无ssDNA作为r（x）的函数。（h）CMP-DNA偶联物的体积加权粒子流体动力学大小（D H）作为R（x）的函数。面板F和G中的实线是拟合参数r f lemal = 0.42 dna/nm 2和n = 6.3和r falt = 0.48 dna/nm 2和n = 4.5的山丘方程。比例尺分别在面板（a）和（b）中为50和100 nm。