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使用合成的激子传输工程耦合...
图 1 | 使用 DNA 支架形成 Cy3 聚集体的化学方法。 (a) Cy3 (左) 共价连接到单链 DNA (ss-DNA) 脱氧核糖磷酸骨架的 3' 和 5' 端。 Cy3 修饰的 DNA 纳米结构是通过将 Cy3 修饰的 ssDNA 与规范互补的 ssDNA 链杂交而形成的，如连接到 DNA 双链体的 Cy3 单体的分子动力学快照 (中间) 和示意图 (右、上) 中蓝色椭圆表示 Cy3 所示。 Cy3 二聚体和三聚体是通过将连续的 Cy3 发色团连接到 ssDNA 并与互补链杂交而形成的 (右、中和下) (b) Cy3 单体 (棕色)、二聚体 (蓝色) 和三聚体 (绿色) 的吸光度 (实线) 和量子产率归一化的荧光光谱 (虚线)。 [DNA 双链] = 0.5 µ M，溶于 40 mM Tris、20 mM 醋酸盐、2 mM 乙二胺四羧酸 (EDTA) 和 12 mM MgCl 2 (TAE-MgCl 2 缓冲液)。(c) 双链中 Cy3 单体、二聚体和三聚体的荧光量子产量 (ΦF)。[DNA 双链] = 0.5 µ M，溶于 1 × TAE-MgCl 2 缓冲液。(d) Cy3 单体、二聚体和三聚体的圆二色性 (CD) 光谱。(e) Cy3 单体、二聚体和三聚体的荧光衰减轨迹，仪器响应函数以黑色显示。
护理人员报告的负担
摘要：败血症是一种极其危险的医疗状况，它是从人体对先前感染的反应中得出的。早期检测败血症的细菌感染可以极大地增强治疗过程，并有可能阻止败血症的发作。但是，当前的护理点（POC）传感器通常是复杂且昂贵的，或者缺乏对有效细菌检测的理想敏感性。因此，开发快速和敏感的生物传感器对于败血症诱导细菌的现场检测至关重要。在这里，我们开发了一种石墨烯氧化物CRISPR-CAS12A（GO-CRISPR）生物传感器，用于检测人血清中脓毒症的菌株。在此策略中，用氧化石墨烯（GO）将单链（ssDNA）FAM探针淬灭。目标激活的CAS12A反式分离用于降解ssDNA探针，从而使短ssDNA探针从GO中脱离并恢复荧光信号。在最佳条件下，我们采用了我们的Go-Crispr系统来检测鼠伤寒沙门氏菌（s。鼠伤寒）在人血清中的检测灵敏度低至3×10 3 CFU/mL，并且对其他竞争细菌具有良好的检测特异性。此外，Go-Crispr生物传感器对S的检测表现出极好的敏感性。尖刺的人血清中的鼠伤寒。Go-Crispr系统为检测败血症的细菌提供了较高的速度，并且有可能增强资源有限环境中细菌感染的早期检测，从而加快了患有败血症风险的患者的反应。■简介
CRISPR/HDR编辑与慢病毒转导的影响对恒河猕猴中HSPC的长期植入和克隆动力学的影响
复制蛋白A（RPA）是单个链DNA（ssDNA）结合蛋白，可协调各种DNA代谢过程，包括DNA复制，修复和重组。RPA是一种异三聚体蛋白，具有六个功能性寡糖/寡核苷酸（OB）结构域和柔性接头。 灵活性使RPA能够采用多种配置，并被认为可以调节其功能。 在此，使用单分子共焦荧光显微镜与光学镊子和粗粒细粒的分子动力学模拟结合使用，我们研究了在张力下ssDNA上单个RPA分子的扩散迁移。 在3 pn张力和100 mM KCl时，扩散系数D是最高（20,000个核苷酸2 /s），当张力或盐浓度增加时，则显着降低。 我们将张力效应归因于段转移，这受到DNA拉伸和盐效应的阻碍，降低了RPA-SSDNA的结合位点大小和相互作用能量的增加。 我们的综合研究使我们能够估计通过通过RPA上多个结合位点在DNA上的遥远位点的短暂桥接发生的细胞分段转移事件的大小和频率。 有趣的是，RPA三聚芯的删除仍然允许大量的ssDNA结合，尽管降低的接触面积使RPA的移动性增加了15倍。 最后，我们表征了RPA拥挤对RPA迁移的影响。 这些发现揭示了如何重塑高亲和力RPA-SSDNA相互作用以产生访问，这是多个DNA代谢过程中的关键步骤。RPA是一种异三聚体蛋白，具有六个功能性寡糖/寡核苷酸（OB）结构域和柔性接头。灵活性使RPA能够采用多种配置，并被认为可以调节其功能。在此，使用单分子共焦荧光显微镜与光学镊子和粗粒细粒的分子动力学模拟结合使用，我们研究了在张力下ssDNA上单个RPA分子的扩散迁移。在3 pn张力和100 mM KCl时，扩散系数D是最高（20,000个核苷酸2 /s），当张力或盐浓度增加时，则显着降低。我们将张力效应归因于段转移，这受到DNA拉伸和盐效应的阻碍，降低了RPA-SSDNA的结合位点大小和相互作用能量的增加。我们的综合研究使我们能够估计通过通过RPA上多个结合位点在DNA上的遥远位点的短暂桥接发生的细胞分段转移事件的大小和频率。有趣的是，RPA三聚芯的删除仍然允许大量的ssDNA结合，尽管降低的接触面积使RPA的移动性增加了15倍。最后，我们表征了RPA拥挤对RPA迁移的影响。这些发现揭示了如何重塑高亲和力RPA-SSDNA相互作用以产生访问，这是多个DNA代谢过程中的关键步骤。
M.Manickavasagam博士...
酸研究，其能够裂解单链DNA（ssDNA）和RNA的能力。该酶源自曲霉细菌，对单链核酸表现出很高的特异性，同时对双链DNA（dsDNA）相对无损（DSDNA）。
碱基编辑器：在活细胞中引入点突变的模块化工具
碱基编辑器是一类新的可编程基因组编辑工具，它将 ssDNA（单链 DNA）修饰酶与催化失活的 CRISPR 相关（Cas）核酸内切酶融合，以诱导高效的单碱基变化。目前已报道了数十种碱基编辑器，显然这些工具是高度模块化的；ssDNA 修饰酶和 Cas 蛋白的多种组合产生了各种碱基编辑器，每种编辑器都有其独特的属性和潜在用途。从这个角度来看，我们描述了当前可用的碱基编辑器，强调了它们的模块化特性并描述了每个组件可用的各种选项。此外，我们简要讨论了合成生物学和基因组工程中的应用，在这些应用中，碱基编辑器比其他技术具有独特的优势。
碱基编辑酶 APOBEC3A 以低效率和高选择性催化 RNA 中的胞嘧啶脱氨
A3A 和 eA3A 表达。A3A 表达构建体 (Addgene #109231) 之前已有描述，可用于纯化 A3A 作为融合蛋白 (MBP-A3A-His)，可进一步加工以生成分离的 A3A 结构域。32,33 对于 eA3A (A3A-N57G)，N57G 突变是通过 Q5 定点诱变 (New England Biolabs, NEB) 引入的。A3A 和 eA3A 构建体的细菌表达之前已有详细描述。 33 将纯化的 MBP-A3A-His、MBP-eA3A-His 或分离的 A3A 在 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.5 mM DTT 和 0.01% Tween-20 中透析过夜，并使用 BSA 标准曲线确定蛋白质浓度。基于 SwaI 的脱氨酶对 ssDNA 和嵌合底物的活性。5'-荧光素 (FAM) 荧光标记的底物 S35-dC 或具有单个靶核糖胞嘧啶的匹配底物（在其他 DNA 骨架中）（S35-rC）由 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成，以及相关产品对照（S35-dU 和 S35-rU）。在最佳 A3A 反应条件（最终为 20 mM 琥珀酸：NaH 2 PO 4：甘氨酸 (SPG) 缓冲液 pH 5.5，0.1% Tween-20）下，用 6 倍稀释的未标记 A3A（从 1 µM 到 4 pM）处理 100 µM 寡核苷酸。反应在 37 ˚C 下进行 30 分钟，然后终止（95 ˚C，10 分钟）。然后加入 200 nM 互补链并退火。加入 SwaI (NEB)，在室温下消化过夜。加入甲酰胺上样缓冲液，样品加热变性（95 ˚C，20 分钟），然后在 50 ˚C 下在 20% 变性 TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用 Typhoon 成像仪（GE Healthcare）上的 FAM 滤光片对凝胶进行成像。使用 ImageJ 中的面积量化工具进行定量分析。720 碱基对 ssDNA 底物的合成。为了生成 ssDNA，使用 720 bp gBlock 基因片段 (IDT) 作为模板 (补充图 2a)，并使用 Taq 聚合酶 (NEB) 进行扩增，采用指数后线性 (LATE) PCR 反应方案，该方案采用相对于磷酸化的反向引物过量的正向引物。32 对反应物进行纯化 (NucleoSpin、Fisher)，然后在 37 ˚C 下用 核酸外切酶处理 1 小时以降解磷酸化链，然后进行热失活 (90 ˚C，10 分钟)。然后将产物在 2% 琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶 DNA 回收试剂盒 (Zymoclean) 回收 ssDNA。通过乙醇沉淀进一步纯化 ssDNA，并使用 Qubit ® 荧光计 (ThermoFisher) 测量其浓度。对于一个重复，ssDNA 以大分子寡核苷酸 (IDT) 的形式获得，并通过乙醇沉淀进一步纯化。720 聚体 RNA 底物的合成。使用 720 bp 基因块 (IDT) dsDNA 作为模板，在推荐条件下使用 TranscriptAid Enzyme Mix (ThermoFisher) 通过体外转录生成 RNA，并在 37 ˚C 下孵育两小时。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化 RNA。将样品重新悬浮在无核酸酶的水中，并进一步用 MspI、XbaI 和 AclI 限制性酶 (NEB) 处理以消化任何剩余的 DNA 模板。在 37 ˚C 下孵育 1 小时后，使用 RNA Clean and Concentrator-5 试剂盒 (Zymo Research) 纯化 RNA。为了进一步确保完全去除模板 DNA，在 37 ˚C 下用 DNase I (Ambion) 处理 RNA 30 分钟。重复纯化 (RNA Clean and Concentrator-5)，并使用 Qubit ® 荧光计测量纯化 RNA 的浓度。通过“预测二级结构网络”预测 720 聚体中几个中尺度区域的二级结构
使用响应表面方法（RSM）
电化学生物传感器依赖于因固定的生物学识别元件与分析物（例如ssDNA/RNA-SSDNA，APTAMER-抗原/蛋白质，抗体 - 抗体 - 抗体 - 抗原抗原和全细胞抗原/蛋白质/蛋白质）之间的分析，依赖于可测量的氧化还原电流的变化。在其中，DNA杂交涉及ssDNA/ RNA之间的相互作用及其互补靶序列，被广泛用于电化学感测中，以检测特异性c DNA序列。对DNA探测器的互补靶标高度可及性，用于DNA杂交的电极表面在增强电化学DNA杂交检测方面起着至关重要的作用。除了取决于杂交过程的最佳条件的改善外，还需要考虑用于固定和杂交的感应层。良好的感应层可以增强生物传感器电化学信号的固定化和DNA杂交。许多研究通过使用纳米材料（例如多壁碳纳米管（MWCNT），11个氧化锌纳米颗粒，11个金纳米颗粒，12
hmces -dna- ...
保守的蛋白质HMCE交联至ssDNA中的abasic（AP）位点，以防止链分裂和复制过程中有毒dsDNA断裂的形成。在这里，我们报告了HMCES-DNA-蛋白交联（DPC）的非蛋白水解释放机制，该机制受DNA环境调节。在ssDNA和ssDNA-DSDNA连接处，HMCES-DPC稳定，可以有效保护AP位点免受自发切口或APE 1 endonucle-ase的裂解。相比之下，HMCES-DPC在DSDNA中释放，允许APE 1启动下游修复。从机械上讲，我们表明释放受两个组件的控制。首先，在HMCE的活性部位内，保守的谷物残留物催化了交叉链接的逆转。第二，与基础DNA结构的亲和力确定了HMCES是重新连接的或解离的。我们的研究表明，HMCES-DPC的保护作用涉及通过复制叉绕过途径释放的控制作用，这将DPC的形成限制为必要的最小值。
