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锌指蛋白靶向霍乱毒素A（ctxA）基因...
摘要 背景与目的：本研究利用锌指核酸酶（ZFN）技术破坏霍乱毒素基因（ctxA），抑制霍乱弧菌（V. cholera）产生CT毒素。实验方法：设计一个工程化的ZFN，靶向ctxA基因的催化位点，将ZFN编码序列克隆到pKD46、pTZ57R T/A载体和E2-crimson质粒中，转化大肠杆菌（E. coli）Top10和霍乱弧菌，通过菌落计数法评估ZFN的转化效果。结果：转化后的大肠杆菌经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹实验未见表达，ctxA基因测序未见突变，pKD46-ZFN质粒聚合酶链式反应结果为阴性。用含有完整 ZFN 序列的 T/A 载体转化大肠杆菌 Top10 产生 7 个菌落，所有菌落均含有具有自连接载体的细菌。用左阵列 ZFN 转化产生 24 个菌落，其中 6 个含有具有自连接载体的细菌，18 个含有具有载体/左阵列的细菌。用含有完整 ZFN 的 E2-深红色载体转化霍乱弧菌未产生任何菌落。用左阵列载体转化产生 17 个含有具有载体/左阵列的细菌的菌落。使用蛋白质印迹分析捕获左阵列蛋白带。结论和意义：由于缺乏非同源末端连接 (NHEJ) 机制，ZFN 可能脱靶细菌基因组，从而导致致命的双链 DNA 断裂。建议开发针对细菌基因的 ZFN，具有 NHEJ 修复系统的工程包装宿主是必不可少的。关键词：ctxA 基因；基因编辑工具；霍乱弧菌；锌指核酸酶。
提高国产基因组编辑工具“锌指-ND1”的功能性......
修改目标 DNA 的基因组编辑工具是基因和细胞治疗的有力工具。目前主要的基因组编辑工具是CRISPR-Cas，应用最为广泛；其次是TALEN；最后是ZFN，应用最少。其中CRISPR-Cas和TALEN的基本专利将持续到2030年甚至更晚，因此在医疗领域使用需要高额的授权费用。另一方面，ZFN的基本专利已于2020年到期，它是一种可免许可使用的基因组编辑工具。通过将识别DNA的Zinc Finger与切割DNA的FirmCutND1 Nuclease（由广岛大学自主开发）相结合，可以制作出名为“Zinc Finger-ND1”的纯国产基因组编辑工具。然而，构建功能性ZFN并提高其基因组编辑效率极具挑战性。 [研究成果总结] 传统上，创建ZFN的主流方法是从随机重排的ZF中筛选与目标DNA结合的ZF。然而，创建功能性 ZFN 大约需要两个月的时间，这需要大量的时间和精力。另外，人们设计了一种称为“模块化组装”的方法，用于将 ZF 在基因上连接起来，但在制作三指 ZFN（三个 ZF 连接在一起）时，获得功能性 ZFN 的概率约为 5%，由于生产效率低，该方法无法使用。我们假设，手指数量少导致可识别的碱基数量减少，从而导致产生功能性 ZFN 的效率降低。因此，在本研究中，我们采用模块化组装的方式构建了一个6指ZF-ND1（图1），以增加其识别的碱基数量。结果，我们构建的10个ZF-ND1中，有两个被证实具有基因组DNA切割活性，这意味着我们以20%的概率成功获得了功能性ZFN。为了进一步完善ZF-ND1的功能，我们使用结构建模技术（AlphaFold、Rossetta和Coot的分子建模）来模拟ZF和DNA之间的相互作用（图2）。通过与 Zif268（一种与 DNA 结合的天然 3 指 ZF）的 DNA 相互作用模型进行比较，确定了五种候选突变。此外，通过比较与 Zif268 的 DNA 糖磷酸骨架结合的氨基酸，确定了四个突变候选者。当将这九个候选突变逐一引入功能性 ZF-ND1 时，发现其中三个突变（图 3）可提高基因组 DNA 切割活性。 V109K突变使裂解活性提高了5%，并且我们成功在结构建模的基础上增强了ZF-ND1的功能。
生命科学的基因组编辑革命∗
可编程的核酸酶 - ZFN，Talens和CRISPR-CAS9 - 配备了具有前所未有的能力，几乎可以随意修饰细胞和生物，在整个生命科学上都有巨大的暗示：生物学，农业，生态学和医学。基于核酸酶的基因组编辑（又称基因编辑）取决于对靶向双链断裂（DSB）的细胞反应。第一个真正可靶向的试剂是锌纤维NU-酸盐（ZFN），表明哺乳动物基因组中的任意DNA序列可以通过蛋白质工程来解决，并在基因组编辑时代介导。ZFN是锌纤维蛋白（ZFP）和FOKI裂解结构域的融合，这是由IIS型Foki型酶的基础研究产生的，该研究显示了具有可分离的DNA结合域和非特定型裂解的二重结构。对3-纤维ZFN的研究确定，预先经过的底物是配对的结合位点，这使目标识别序列的大小从9至18 bp的大小增加了一倍，足以指定植物和包括人类细胞在内的植物和哺乳动物细胞中的独特基因组基因源。随后，显示了ZFN诱导的DSB，可刺激青蛙卵中的同源性结合。基于与Foki裂解结构域融合的细菌故事的转录活化剂样核酸酶（Talens）扩大了能力。Zfn和Talens已成功地用于修改多种顽固的生物和细胞类型，这些生物和细胞类型既不是在先前证明了蛋白质工程的成功，否则很久以前就在CRISPR的到来之前很久。最近向细胞基因组传递靶向DSB的技术是RNA引导的核酸酶，如II型原核生物
crispr/cas-解码生命-迷你评论
摘要 自 1990 年首次使用以来，基因治疗已成为各种疾病治疗方式中不断扩展的一部分。尽管最初出现了一些挫折，导致结果不尽如人意，但科学的进步通过使用重新设计的病毒、非病毒载体、免疫原性反应的多个检查点和诱变，重新点燃了基因治疗的热情。最近，该领域正在经历一种范式转变，其中不是将治疗基因引入基因座，而是一种更无风险的解决方案，即精确地原位修复现有的遗传异常。这是通过引入 CRISPR/Cas 系统和之前的系统（例如 ZFN 和 TALEN）实现的。本文回顾了 CRISPR/Cas 在牙科中的应用，并阐明了其他系统（例如 ZFN 和 TALEN）关键词：CRISPR/Cas 系统、牙周炎、基因组编辑、锌指核酸酶。
CRISPR技术在植物基因组编辑中的应用
新型基因编辑技术中使用的核酸酶主要有四类，分别是：巨核酸酶、锌指核酸酶（ZFN）；转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)；以及成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 相关 (Cas) (Gaj 等人，2016)。巨核酸酶是一种在特定区域切割 DNA 的内切核酸酶，可识别大于 12 bp（碱基对）的序列。 LAGLIDADG 巨核酸酶家族包含 I-CreI 和 I-SceI，它们是第一种用于基因编辑的酶。由于只有少数氨基酸残基与核苷酸接触，这些酶被设计用于在特定位点切割基因（Paques；Duchateau，2007）。此外，ZFN 是一种人工酶，也是最早用于诱导植物靶向突变的酶之一。这些酶是由锌指型结构域和限制性酶 Fok I 的结构域融合产生的。与基因编辑中使用的其他核酸酶一样，ZFN 会在需要修复的 DNA 特定位置插入双链断裂 (DSB)，并且由于修复机制中的故障，可能会出现突变 (Carroll, 2011)。使用该系统的主要问题是这种酶的高毒性，以及它会产生许多脱靶效应（Cornu et al., 2008; Ramirez et al., 2008），这会损害不应改变功能的基因的功能（Zhang et al., 2015）。随着版本的合并
米粒的产量和质量改善通过CRISPR/ ... div>
a，b这些作者对摘要摘要摘要大米（Oryza sativa L.）是全球重要的主食。面对气候变化，需要改善水稻的定性和定量特征，满足人口增加的营养需求不断增长。近年来，基因组编辑在谷物作物的优质种类的发展中发挥了重要作用。基因组编辑和速度繁殖提高了水稻育种的准确性和速度。在大米中已经建立了包括基因组编辑在内的新育种技术，从而扩大了作物改善的潜力。在十年中，诸如锌指核酸酶（ZFN），转录激活剂样效应核酸酶（Talens）（Talens）和群集定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CAS9）系统（CAS9）系统使用蛋白质9（Cas9）系统的诸如锌指核酸酶（ZFN）（ZFN），类似于转录激活剂样效应子核酸酶（Talens）（Talens）（CAS9（CAS9），并在赖斯分配中起着非常出色的作用。 此外，最近的其他基因组编辑技术（例如Prime编辑和基础编辑者）也已用于大米中的有效基因组编辑。 由于大米是一个出色的模型系统，因此由于其小基因组和与其他谷物作物的密切合成关系，因此继续开发用于大米的新基因组编辑技术。 采用基因组编辑技术（GET）等基因组改变进行了反向遗传学，已经在农业科学（例如水稻产量和谷物质量改善）方面开辟了新的途径。 这些方法的有效性正在全球研究人员和作物科学家验证。诸如锌指核酸酶（ZFN）（ZFN），类似于转录激活剂样效应子核酸酶（Talens）（Talens）（CAS9（CAS9），并在赖斯分配中起着非常出色的作用。此外，最近的其他基因组编辑技术（例如Prime编辑和基础编辑者）也已用于大米中的有效基因组编辑。由于大米是一个出色的模型系统，因此由于其小基因组和与其他谷物作物的密切合成关系，因此继续开发用于大米的新基因组编辑技术。采用基因组编辑技术（GET）等基因组改变进行了反向遗传学，已经在农业科学（例如水稻产量和谷物质量改善）方面开辟了新的途径。这些方法的有效性正在全球研究人员和作物科学家验证。目前，CRISPR/CAS9技术被研究人员广泛用于基因组编辑，以实现所需的生物学目标，因为它具有简单的定位，易于设计，具有成本效益和多才多艺的工具，用于精确有效的植物基因组编辑。在过去的几年中，通过CRISPR/CAS9技术方法成功编辑了许多与水稻纹理质量和产量相关的基因，以满足全球对食品需求不断增长的需求。在这篇综述中，我们着重于用于水稻改进的基因组编辑工具，以解决取得的进展，并提供大米基因组编辑的例子。我们还讨论了获得无转基因作物的安全问题和方法。
基因组编辑技术，机制和改善治疗性植物化学物质的产生：机会和前景
图1各种基因组编辑工具。（a）锌指核酸酶（ZFN）充当二聚体。每个单体由DNA结合结构域和核酸酶结构域组成。每个DNA结合结构域由3 - 6个锌指重复序列组成，识别9 - 18个核苷酸。核酸酶结构域由II型限制性核酸内切酶FOK1组成。（b）转录激活剂类似核酸酶（Talens）：这些是类似于ZFN的二聚体酶。每个亚基由DNA结合结构域（高度保守的33 - 34个氨基酸序列）和FOK1核酸酶结构域组成。（c）CRISPR/CAS9：CAS9核酸内切酶由SGRNA（单引导RNA：CRRNA和TRACRRNA）引导，用于靶特定裂解。二十个核苷酸识别位点存在于原始基序（PAM）的上游（来自Arora＆Narula，2017年）。版权所有©2017 Arora和Narula。这是根据Creative Commons归因许可（CC BY）的条款分发的开放访问文章。
CRISPR系统 - 编辑基因
crispr代表c的c luster r r e nterspaced s hort hort hort s to ailindromic r epeats，是细菌基因组的术语，该术语盛行，该术语代表用于精确执行细胞遗传质量变化的成分的编码。在发现CRI SPR之前，基因重新的方法已被缺乏精确和/或使用非常资源的方法。随着所谓的“基于核酸酶”的基因源技术的发展发生了变化。锌指（ZFN），1990年代后期（2）的转录活化剂样效应核酸酶（语音）和毛核酸酶。这些核心所见是将DNA链切开的酶，导致它们在遗传中的预定位置引起双弦骨折（两个DNA弦中的两个DNA串中的两个DNA弦）（图。1）。作为研究人员，我们可以利用前面提到的四个（ZFN，语音，巨核和CRISPR）分子基因剪刀在细胞中的DNA中“切割”一个特定位置。这些方法在此允许研究人员设计其基因剪刀以切成基因组的预定位置，从而可以有效，准确地改变，
基因组编辑技术在人类疾病靶向治疗中的应用：机制、进展与展望
基于工程或细菌核酸酶，基因组编辑技术的发展开启了直接靶向和修改几乎所有真核细胞中的基因组序列的可能性。基因组编辑通过促进创建更准确的病理过程细胞和动物模型，扩展了我们阐明遗传学对疾病的贡献的能力，并已开始在从基础研究到应用生物技术和生物医学研究的各个领域展现出非凡的潜力。在开发可编程核酸酶方面取得的最新进展，例如锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶 (TALEN) 和成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) - Cas 相关核酸酶，极大地加快了基因编辑从概念到临床实践的进程。本文回顾了三种主要基因组编辑技术（ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas9）的最新进展，并讨论了其衍生试剂作为基因编辑工具在各种人类疾病和未来潜在疗法中的应用，重点关注真核细胞和动物模型。最后，我们概述了应用基因组编辑平台治疗疾病的临床试验以及实施该技术的一些挑战。
评论文章 基因编辑和 CRISPR 在临床中的应用：当前和未来的前景
基因组编辑技术，特别是基于锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复 DNA 序列）/Cas9 的技术，正在迅速进入临床试验。迄今为止，CRISPR 的大多数临床应用都集中在体外对细胞进行基因编辑，然后将其重新引入患者体内。体外编辑方法对许多疾病状态都非常有效，包括癌症和镰状细胞病，但理想情况下，基因组编辑也应用于需要体内细胞改造的疾病。但是，CRISPR 技术的体内使用可能会因脱靶编辑、低效或脱靶递送以及刺激适得其反的免疫反应等问题而受到阻碍。当前针对这些问题的研究可能为 CRISPR 在临床领域的应用提供新的机会。在这篇综述中，我们研究了 ZFN、TALEN 和基于 CRISPR 的基因组编辑的临床试验的现状和科学基础、CRISPR 在人类中使用已知的局限性，以及快速发展的 CRISPR 工程领域，这些为进一步转化为临床应用奠定基础。