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AAV-RPGR 基因疗法挽救人类视网膜类器官模型中 RPGR 相关 X 连锁视网膜色素变性的视蛋白错误定位
摘要：视网膜色素变性 GTPase 调节剂 (RPGR) 基因内的变异是 X 连锁视网膜色素变性 (XLRP) 的主要原因，XLRP 是一种常见且严重的遗传性视网膜疾病。XLRP 的特征是光感受器的逐渐退化和丧失，导致视力丧失，并最终导致双侧失明。不幸的是，目前尚无针对 RPGR 相关 XLRP 的有效批准治疗方法。我们试图使用临床相关构建体研究 RPGR ORF15 基因补充在人类 RPGR 缺陷型视网膜类器官 (RO) 中的有效性。使用针对 RPGR 的成熟 CRISPR/Cas9 基因编辑方法生成同源 RPGR 敲除 (KO) 诱导的多能干细胞 (IPSC)。RPGR-KO 和同源野生型 IPSC 分化为 RO，并用于测试腺相关病毒 (AAV) RPGR (AAV-RPGR) 临床载体构建体。使用 AAV-RPGR 转导 RPGR-KO RO 成功恢复了 RPGR mRNA 和蛋白质的表达，并定位到杆状和锥状感光细胞中的感光连接纤毛。载体衍生的 RPGR 显示出与 WT RO 相同的谷氨酰化水平。此外，用 AAV-RPGR 治疗可恢复 RPGR-KO RO 内的视紫红质定位，从而减少对感光外核层的错误定位。这些数据提供了对 RPGR ORF15 基因补充在人类感光细胞中的功能效力的机制见解，并支持了之前报道的在 RPGR 相关 XLRP 患者中使用该载体构建体进行的 I/II 期试验的积极结果，该载体构建体目前正在进行 III 期临床试验。
神经肌肉疾病的产后基因治疗
对于神经肌肉疾病，基因增强或基因添加是目前最先进的治疗方式。这种疗法添加了有缺陷基因的功能性拷贝，以促进目标蛋白的产生。除了第一代基因疗法之外，基因编辑技术正在实现一种基于精确修改人类基因组序列的全新治疗方式。这些技术目前才开始进行临床测试 [1]。病毒载体是基因治疗中最常用的药物，因为它们能够将许多治疗基因拷贝递送到靶细胞。最常用的类型包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和腺相关载体。慢病毒载体能够将其遗传信息整合到靶细胞的基因组中，而腺相关载体则不会整合到靶细胞的基因组中。相反，遗传信息作为附加体保留在细胞核中。因此，这些载体可以在不改变宿主细胞基因组的情况下表达治疗基因，但它们的使用主要限于非分裂细胞。基因转移可以在体外或体内进行（图 1）。体外基因治疗最先进的用途是利用慢病毒载体改造造血干细胞，以治疗地中海贫血等遗传性疾病。体内方法主要基于腺相关载体 (AAV)，目前用于治疗神经肌肉疾病、视网膜病或血友病 [2]。基于 AAV 的基因疗法的主要局限性包括对基因传递载体和外来转基因产物的免疫反应。这些反应通常需要预防性或反应性免疫调节治疗。目前，一些患者由于预先存在针对载体衣壳的抗体而被排除在基于 AAV 的基因疗法之外。本文将回顾神经肌肉疾病创新和突变特异性治疗的当前发展状况，并讨论对受影响患者及其家属的诊断和咨询的影响。
通过病毒，细胞外囊泡和纳米颗粒的纳米孔进行光学定量
图1：A。本研究中使用的颗粒和实验方案的特征。从上到下：VLP HIV，像人免疫缺陷病毒的粒子一样； MLV，鼠白血病病毒； HBV，肝素B病毒； AAV，Adeno相关病毒（血清型8和9）；电动汽车，细胞外囊泡。需要荧光标记颗粒：可以通过基因组修饰（HIV和MLV的GFP标记）或直接通过在样品中添加荧光团（AAV和HBV的Yoyo-1，EVS的DIO）来实现。潜在的细胞DNA在VLP HIV和EV中以红色表示，MLV中的粉红色病毒RNA和HBV和AAV中的紫色病毒DNA表示。然后将样品稀释。大小由NTA确定HIV，MLV和EVS，以及AAV 37和HBV 38的冷冻EM重建。B.零模式波导设置，用于通过纳米孔转移的颗粒。顺式腔室包含荧光标记的颗粒。在施加压力时，颗粒在跨室中的孔中推动，并在孔末端越过evanevencent的田地区域时照亮。一旦他们离开了毛孔，他们就没有专心和漂白。C.事件的荧光演变是时间和粒子出口快照的函数。归一化强度表示为AAV时间的函数（紫罗兰和红点，平均在n = 50事件上）。通过最大强度分配强度获得归一化强度。时间在事件开始时被重新缩放至零，红点与事件发生前的强度相对应。指数衰减以蓝色表示。孔径400 nm，施加压力为0.5 mbar。帧速率：112 fps。插图：图像尺寸= 10 µm。
利用链球菌进行体内多重基因靶向...
胰腺导管腺癌是一种致命的癌症类型，与体细胞中的多种基因突变有关。基因工程小鼠几乎不适用于开发胰腺癌模型，异种移植模型在反映早期胰腺癌方面存在局限性。因此，使用成簇的规律间隔的短回文重复序列进行体内体细胞基因工程用于生成胰腺癌动物模型越来越受到关注。在本研究中，我们选择了 Kras、Trp53、Ink4a、Smad4 和 Brca2 作为靶基因，并应用空肠弯曲菌 Cas9 (CjCas9) 和化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 通过腺相关病毒 (AAV) 转导来开发胰腺癌。在确认 AAV2 的多灶性和弥漫性转导后，我们生成了 SpCas9 过表达小鼠，该小鼠在两次 AAV 转导后表现出靶基因中高双链 DNA 断裂 (DSB) 和胰腺上皮内瘤变 (PanIN) 病变；然而，三次 AAV 转导的野生型 (WT) 小鼠没有出现 PanIN。此外，将小型 Cjcas9 应用于具有两个 AAV 系统的 WT 小鼠，该小鼠还出现了高广泛性 DSB 和 PanIN 病变。观察到了导管和胰岛细胞中的组织学变化和癌症标志物（如 Ki67、细胞角蛋白、Mucin5a、α 平滑肌肌动蛋白）的表达。此外，研究还揭示了几个发现，例如 1) AAV-CjCas9 的多重 DSB 潜力、2) 导管周围淋巴细胞浸润、3) 多灶性癌症标志物表达，以及 4) 在 AAV 介导的靶向中启动 PanIN 需要 12 个月以上。在这项研究中，我们提出了一种用于体内癌症建模的有用工具，该工具也适用于其他疾病模型。
优化的质粒式骨架可有效RAAV制造
重组腺相关病毒（RAAV）是用于传递遗传信息的最深入研究和最广泛使用的载体之一。但是，将遗传货物向受体细胞有效地转移需要高矢量剂量。质粒DNA（pDNA）是用于制造Raav的关键原料。可以生产的病毒滴度取决于辅助，包装和转移质粒转染的细胞数量以及其生物学活性。因此，对优化质粒的高级疗法需求的开发和应用表现出较高的生物学活性，可以以高质量和数量生产。这些原材料的可用性和负担能力反过来要求高性能生产过程，这些过程的特征是高产品滴度，质粒DNA纯度和可伸缩性。这些特征受到靶质粒的特定序列的影响，尤其是那些对RAAV功能至关重要的序列。Wacker开发了一个专有的饲料批次工艺，该过程最佳地支持了质膜菌株的生长，并允许最佳的质粒复制。此过程允许在高特异性滴度和高纯度下进行可扩展的质粒DNA（包括关键的RAAV制造原材料）的可扩展生产和隔离。使用此过程，我们开发了特定的DNA序列，从而进一步提高了靶质粒的生产率，从而降低了制造成本。并行，我们筛选替代质粒结构，以提高其转染效率和包装细胞系中的生物学活性。结合了由此产生的技术，我们开发了专有质粒，可以进一步促进RAAV制造。具有其生产力，灵活性和可扩展性，Plasmitec®制造平台提供了高质量且负担得起的原材料，因此是开发和应用高级疗法的宝贵促进者。
Richard John Kryscio
完整的处方信息1指示和用法Roctavian是一种基于腺相关病毒载体的基因疗法，用于治疗患有严重血友病A的成年人（先天性因子VIII缺乏，VIII因子VIII活性<1 IU/DL）而无需抗adeno搭配的Virussepype 5（Anavrappaimed Virus sestype）。2剂量和给药一次性单剂量静脉用途。用roctavian治疗应受到治疗血友病和/或出血疾病的医生的监督。用于患者选择•使用FDA批准的伴侣诊断进行测试，以对AAV5进行预先存在的抗体。不要为对AAV5抗体的阳性测试的患者进行Roctavian。有关FDA批准的测试的信息，可在以下网址提供：http：//www.fda.gov/companiondiangnostics。•执行VIII抑制剂滴度测试[请参阅特定种群中的使用（8.7）和临床药理学（12.6）]。不要向因子VIII抑制剂进行阳性测试的患者施用roctavian。•进行肝健康评估，其中包括：•肝功能测试[丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），γ-谷氨酰基转移酶（GGT），碱性磷酸酶（ALP），全胆红素和国际正常化的评估（Inrastripation（INRAS））放射肝异常和/或肝功能测试异常（ALT，AST，GGT，ALP或总胆红素> 1.25×ULN或INR≥1.4），请考虑与肝病学家进行协商以评估Roctavian的资格。•评估患者接受皮质类固醇和/或其他免疫抑制治疗的能力，这可能是长时间的[参见剂量和给药（2.3）]。确保个别患者可以接受与免疫抑制相关的风险。•请勿为活性急性或不受控制的慢性感染，已知明显的肝纤维化（Batts-ludwig量表或同等学历）或肝硬化的患者进行roctavaian，或者在特定群体中使用（4），已知的肝纤维化（阶段3或4阶段）或cir骨高度超敏。
基因组编辑器的体内靶向非病毒递送
RNA 引导的 CRISPR-Cas 酶因其功效、灵活性和易用性而被广泛用于基因组编辑 [已在其他地方进行综述 (1, 2)]。虽然 Cas9 等 CRISPR 蛋白已经在临床试验中显示出良好的前景，但对人类基因组造成永久性改变的现实意味着安全性至关重要。在基因组层面，Cas9 的特异性已通过预测脱靶位点的方法 (3, 4) 和分子工程来产生高保真度蛋白质 (5) 进行了优化。然而，一项将提高基因组编辑的实用性和安全性的关键发展是能够将 CRISPR-Cas 基因组编辑机制专门递送到患者体内所需的细胞类型、组织或器官。对于许多遗传疾病，只有一小部分细胞或特定器官表现出疾病的表型迹象，因此将成为基因组编辑的预期目标。对非预期细胞或器官进行基因组编辑可能会增加意外治疗结果的风险，此外还会因更高的剂量要求而增加制造成本。目前，CRISPR-Cas 基因组编辑器的靶向递送仍然是成功实现基因组编辑临床转化的重要未满足需求。病毒载体缺乏其天然基因组和复制能力，是基因治疗和最近的 CRISPR-Cas 基因组编辑的一种有吸引力的递送策略[在其他地方进行了综述 (6)]。最广泛使用的病毒载体是逆转录病毒和腺相关病毒 (AAV) (7, 8)。慢病毒载体是逆转录病毒的一个亚型，在基因组整合后表达较大的转基因 (~ 10 kb)，而 AAV 表达较小的转基因 (~ 4.7 kb)，来自长寿命的附加体；这两种病毒载体都能够转导分裂细胞和非分裂细胞。假型慢病毒载体 (9)、新 AAV 趋向性工程 (10) 和组织特异性启动子使用的进展使得这些技术能够实现细胞特异性递送。然而，病毒递送也引入了
基因组编辑器的体内靶向非病毒递送
RNA 引导的 CRISPR-Cas 酶因其功效、灵活性和易用性而被广泛用于基因组编辑 [已在其他地方进行综述 (1, 2)]。虽然 Cas9 等 CRISPR 蛋白已经在临床试验中显示出良好的前景，但对人类基因组造成永久性改变的现实意味着安全性至关重要。在基因组层面，Cas9 的特异性已通过预测脱靶位点的方法 (3, 4) 和分子工程来产生高保真度蛋白质 (5) 进行了优化。然而，一项将提高基因组编辑的实用性和安全性的关键发展是能够将 CRISPR-Cas 基因组编辑机制专门递送到患者体内所需的细胞类型、组织或器官。对于许多遗传疾病，只有一小部分细胞或特定器官表现出疾病的表型迹象，因此将成为基因组编辑的预期目标。对非预期细胞或器官进行基因组编辑可能会增加意外治疗结果的风险，此外还会因更高的剂量要求而增加制造成本。目前，CRISPR-Cas 基因组编辑器的靶向递送仍然是成功实现基因组编辑临床转化的重要未满足需求。病毒载体缺乏其天然基因组和复制能力，是基因治疗和最近的 CRISPR-Cas 基因组编辑的一种有吸引力的递送策略[在其他地方进行了综述 (6)]。最广泛使用的病毒载体是逆转录病毒和腺相关病毒 (AAV) (7, 8)。慢病毒载体是逆转录病毒的一个亚型，在基因组整合后表达较大的转基因 (~ 10 kb)，而 AAV 表达较小的转基因 (~ 4.7 kb)，来自长寿命的附加体；这两种病毒载体都能够转导分裂细胞和非分裂细胞。假型慢病毒载体 (9)、新 AAV 趋向性工程 (10) 和组织特异性启动子使用的进展使得这些技术能够实现细胞特异性递送。然而，病毒递送也引入了
CBF表达1（ICE1）的诱导剂促进冷 - 一个神经语音解码框架利用深度学习和语音综合 使用pydna-epbd检查DNA呼吸 新鲜人脑的本地超微结构直接从尸检中剥离，由低温电子层析成像揭示出具有冷冻血压浓缩的离子束铣削 转录细胞周期蛋白依赖性激酶的小分子抑制剂施加了HIV-1潜伏期，呈现“块和锁定”治疗策略 通过人类生命跨度的功能连接 青少年和年轻人的皮质回旋和睡眠之间的关联 序列特异性DNA结合蛋白的计算设计 auranofin诱导了由活性氧驱动的高级氧气驱动的致死性 基因组，功能性和代谢增强在多种耐药的肠杆菌中，促进了国际空间站的持久性和继承 单碳代谢营养素影响肝脏中DNA甲基化和基因表达之间的相互作用，增强了大西洋鲑鱼中的蛋白质合成 标题：期间从头和打捞嘌呤合成的时空调节 1原位冷冻揭示了抑制剂引起的扰动。 宇宙是不对称的，小鼠大脑也是 串联和整个基因组重复的蜘蛛soneobox基因库的演变 adeno到Quamous的过渡驱动对LKB1突变体1 中KRAS抑制的抵抗力
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