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World File Search SystemcDNA
Caredx Inc.（cDNA）
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基因组DNA和cDNA库
基因组库：基因组库也称为克隆银行或基因库。它是来自单个生物体的DNA的集合，尽管不一定一定包含其整个基因组DNA序列。来自感兴趣的源生物的DNA分为多个片段，并包装在克隆载体中，使每个片段都带有一部分。由于以下原因，可以将矢量DNA插入由λ噬菌体载体而不是质粒矢量制成的宿主生物。整个人类基因组的长度约为3 x 109 bp，而质粒或λ噬菌体载体可能带有多达20 kb的碎片。这将需要1.5 x 105重组质粒或λ噬菌体。将大肠杆菌菌落镀在3英寸的培养皿上时，允许单个菌落隔离的最大数量约为每盘菌落。因此，构建人类基因组文库需要至少700种培养皿。相比之下，可以在典型的培养皿上筛选多达5 x104λ噬菌体鼠疫。这仅需要30培养皿来构建人类基因组文库。λ噬菌体载体的另一个优点是其转化效率比质粒载体高约1000倍。互补DNA（cDNA）：cDNA是mRNA的逆转录酶产物，代表mRNA分离时所有转录基因的编码序列
magmax™核心核酸纯化试剂盒
描述Thermo Scientific™First Strand cDNA合成试剂盒是一个完整的系统，用于有效合成mRNA或总RNA模板的第一链cDNA。该试剂盒使用M-Mulv逆转录酶，与AMW逆转录酶相比，RNase H活性较低。酶在37°C下保持活性，适合于9 kb的cDNA合成。套件提供的重组Thermo Scientific™Ribolock™RNase抑制剂可有效保护RNA在高达55°C的温度下免于降解。该套件均配有寡核（DT）18和随机己酯引物。随机六聚体引物与非特异性结合，并用于合成总RNA种群中所有RNA的cDNA。寡（DT）18底漆选择性地向poly（a）RNA的3末端退火，仅从poly（a）尾mRNA中合成cDNA。基因特异性底漆也可以与试剂盒一起使用，以从指定序列中进行质合。与该系统合成的第一链cDNA可以直接用作PCR或实时PCR中的模板。它也是第二链cDNA合成或线性RNA扩增的理想选择。可以将放射性和非放射性标记的核苷酸纳入第一个链cDNA，以用作包括微阵列在内的杂交实验的探针。
人类P2
寡脱氧核苷酸的杂交特性已经以多种技术为特征（1-4）。在适当条件下，寡核苷酸与DNA中的特定位点杂交（4，5）。此外，可以将完美的碱基配对的核苷酸双链体与包含单个不匹配的碱基对（4-6）的复式区分开。我们利用寡核苷酸的杂交特性在开发一种分离特定克隆的DNA序列的方法中（5）。我们的一般方法是化学合成寡核苷酸的混合物，这些寡核苷酸代表给定蛋白的一小部分氨基酸序列的所有可能的密码子组合。在该混合物中必须是与蛋白质该部分编码的DNA相结合的一个序列。这种互补的寡核苷酸将与来自蛋白质的编码区域的DNA形成完美的基础复式，而混合物中的其他寡核苷酸将形成不匹配的双链体。在严格的杂交结合下，只有完美匹配的双链体将形成，从而允许将寡核苷酸的混合物用作特定的杂交探针。混合序列寡核苷酸探针应允许分离出已知氨基酸序列的任何蛋白质的克隆DNA序列。我们已将这种方法应用于人A2-微球蛋白（AM）的克隆cDNA序列的分离。AM是一种从尿液中分离出来的小蛋白（分子量11,800）。随后，发现A3〜m与主要组织相容性基因座的细胞表面抗原相关（8、9）。A2M的确切功能尚不清楚，尽管最近的证据表明该分子可以稳定辅助蛋白的三级结构（10）。氨基酸序列已从包括人类在内的四个物种中定位为F2M（11）。我们已经使用氨基酸序列来设计探针，以分离到人类2M的克隆cDNA。
鼠免疫干扰素cDNA的克隆和表达
鼠免疫干扰素（MUIFN-Y）已从有丝分裂原诱导的小鼠脾培养物（1-4）和T细胞系（5，6）中分离出来。这些制剂尚未被纯化为同种基因，但仍包含有效的体外抗病毒和抗细胞活性（1-6）。muifn-y也可能具有体内静脉功效（7）。我们先前报道了人IFN-Y（HUIFN-Y）的cDNA（8）和基因（9）的分离和表达。该基因编码166个氨基酸的蛋白质；前20个残基是分泌成熟蛋白的信号序列。huifn-'y与huifn-a（白细胞IFN）和huifn-（3（3（成纤维细胞IFN）：huifn-y）：huifn-y是由染色体12（10）上的一个基因编码的，其中包含三个内含子（9）。huifn-a基因家族和单个huifn-，b基因由9（11）染色体编码，没有内含子（12-17）。furore，Huifn-Y的DNA序列和编码的氨基酸序列与Huifn-A序列（8、12、18）或HUIFN-，B序列（15-17）无关。huifn-a和huifn-f3通常在其他物种的细胞系上表现出一些抗病毒活性（19），而huifn-y具有严格的物种表格。因此，在研究潜在抗肿瘤剂的研究中有用的鼠模型系统可能不适用于检查Huifn-Y。因此，muifn-y的来源可能在鼠模型系统中非常有价值，并可能有助于评估Huifn-Y的临床潜力。muifn-a（20）和muifn-，b（T。taniguchi，个人通讯）基因最近被克隆和特征。但是，尚未终止有关MUIFN-Y的结构数据。在某些方面，muifn-y的性质与huifn-y相似； MUIFN-Y的抗病毒活性是置于pH 2和温度（65°C 1小时）（1、2、5）。对MUIFN-A或MUIFN-制备的抗体（3请勿中和Muifn-Y抗病毒活性（3-5）。为了确定muifn-y的结构，进一步表征其特性，并为动物测试提供材料，我们隔离了
第一链cDNA合成试剂盒
图3。凝胶电泳图像捕获超螺旋的，未消除的PUC19（泳道B）；线性PUC19用Hindiii（泳道C）消化； PUC19用苯酚（150 ppm）升高，并消化了印度菌（D）； PUC19用EDTA（20毫米）和Hindiii消化（Lane E）升高。在1.2％的琼脂糖凝胶上运行。梯子在车道A中显示为基座对。
使用 Cas9 和 AAV 研究全长 CFTR cDNA 替换引起的不利基因组和调控变化
一种替代全长 CFTR cDNA 的“通用策略”可治疗 99% 以上的囊性纤维化 (pwCF) 患者，无论他们的具体突变如何。基于 Cas9 的基因编辑被用于在气道基底干细胞的 CFTR 基因座处插入 CFTR cDNA 和截短的 CD19 (tCD19) 富集标签。该策略将 CFTR 功能恢复到非 CF 水平。在这里，我们通过评估 CFTR cDNA 插入后的基因组和调控变化来研究这种方法的安全性。首先通过使用 CAST-seq 量化基因重排来评估安全性。在验证编辑和富集的气道细胞中恢复的 CFTR 功能后，使用 ATAC-seq 表征 CFTR 基因座开放染色质谱。使用 scRNA-seq 评估编辑细胞中的再生潜力和差异基因表达。 CAST-seq 发现 0.01% 的等位基因发生易位，主要发生在非致癌脱靶位点，1% 的等位基因发生大量插入缺失。分化气道上皮细胞的开放染色质谱除 CFTR cDNA 和 tCD19 盒对应的区域外，没有出现明显变化，表明基因调控没有可检测到的变化。编辑后的干细胞产生的气道细胞类型与对照相同，基因表达的改变最小。总体而言，通用策略显示出轻微的不良基因组变化。