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使用 CRISPR/Cas9 和 53BP1 抑制技术通过靶向 CYBB cDNA 插入来修复 X-CGD 患者的 HSPC，从而增强同源性定向修复
蛋白质。我们在此报告了通过同源定向修复在患者造血干细胞/祖细胞 (HSPC) 中进行基因校正，使用 CRISPR/Cas9 将腺相关病毒供体的 CYBB 外显子 1-13 或 2-13 cDNA 靶向插入内源性 CYBB 外显子 1 或外显子 2 位点。外显子 1-13 cDNA 的靶向插入不会恢复生理 gp91 phox 水平，这与 CYBB 表达对内含子 1 的要求一致。然而，外显子 2-13 cDNA 的插入完全恢复了吞噬细胞分化时 gp91 phox 和 ROS 的产生。添加土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件不会进一步增强外显子 2-13 校正细胞中的 gp91 phox 表达，表明保留内含子 1 足以实现最佳 CYBB 表达。使用 i53 mRNA 暂时抑制非同源末端连接，靶向校正增加了约 1.5 倍。在 NSG 小鼠中植入后，校正后的 HSPC 产生了吞噬细胞，并恢复了 gp91 phox 和 ROS 的产生。我们的研究结果证明了
在注释中使用mRNA和EST证据
识别潜在有趣的基因或类似基因的特征的一种方法是使用cDNA数据库。CDNA对于基因鉴定很有用，因为它们是由mRNA制成的，并反映了基因组的表达区域。为了在时间和财务上进行大规模的cDNA测序，随机采用cDNA克隆，并测序cDNA的一端或两端。每个cDNA克隆仅在一个通过中进行测序，就像单个基因组读数一样。这些序列通常称为表达的序列标签（ESTS）。因此，EST是低质量的核酸序列，所有与单读相同的问题。大多数EST仅代表cDNA的一部分（一端或另一端）。但是，它们可以用作构建更完全注释的mRNA的构建块，例如RefSeq mRNA数据库中发现的一些序列。除了相对较低的EST读取质量（大约2％的误差）外，EST还具有其他局限性。通常，归一化程序用于允许对稀有的转录本进行采样。但是，仍然存在偶然的可能性，可能完全因为它们的表现较低或不在给定的库中而完全丢失了稀有的成绩单。转录本也可能遗漏，因为它们未在用于构建各种cDNA文库的组织，细胞类型或发育阶段表达。（有关更多信息，请参见NCBI手册。）在本练习中，我们将使用mRNA和EST序列指导和验证我们的注释工作。
免疫技术放射免疫分析（RIA）
•对感兴趣的基因产物进行抗血清•从表达基因的细胞系中使cDNA表达文库•将基因的c cDNA表达文库转染至细胞系，该细胞系通常不会表达基因产物•通过抗体结合表达产物的选择细胞•恢复cDNA表达载体•重复。恢复。序列。胜利！
kilodalton核帽结合蛋白
已经表明，单甲基化的帽结构在核事件中起着重要作用。盖结构与增强前mRNA剪接有关。最近，还建议这种结构促进RNA从细胞核到细胞质的转运。我们先前已经从HELA细胞核提取物中鉴定出并纯化了8OKD核盖结合蛋白（NCBP），这可能会介导这些核活性。在本报告中，我们描述了编码NCBP的互补DNA（cDNA）的克隆。确定了NCBP的部分蛋白质序列，并从HELA cDNA文库中分离出NCBP的全长cDNA。该cDNA编码了790个氨基酸的开放阅读框，其计算的分子质量为91,734 daltons，其中包含大多数确定的蛋白质序列。但是，蛋白质序列与任何已知蛋白质都没有显着同源性。转染实验表明，在HELA细胞中瞬时表达的表位标记的NCBP仅在核质中定位。使用截短的NCBP cDNA进行的类似实验表明，这种核定位活性由N末端70氨基酸区域赋予。
完全从克隆的互补DNA中拯救第一个alphanucleorhabdovirus：一种有效的载体，用于MAI
fi g u r e 1从植物中的全长cDNA克隆中拯救感染性玉米镶嵌病毒（MMV）。（a）PJL-MMV-WT，PTF-N＆P和PJL-L-Lintron质粒的示意图。全长的MMV型质粒设计用于转录，以产生MMV抗原组RNA（AgRNA），并包含位于截短的CAMV Double 35S启动子（2×35s）和肝炎乙肝（RZ）rzl89 bjl89 bilary prinary prinary pharine pharione phinary phinary phinary phincy sequence之间的全长MMV cDNA。请注意，序列以抗原（mRNA）感显示。在PTF二进制质粒中的2×35s和35s终结序列之间插入了N和P的全长cDNA。L的全长cDNA与植物内含子ST-LS1插入2×35s和35S终结序列之间的植物内含子cDNA，在PJL89二元质粒中。（b）用含有PJL-MMV-GFP，PTF-N＆P和PJL-L-INTRON质粒的农杆菌菌株的农杆菌菌株的示意图，并说明了PJL-MMV-GFP质粒构建。全长PJL-MMV-GFP包含重复的N/P基因连接，将MMV抗原组cDNA的N和P基因之间的GFP基因两侧。le，领导者； TR，拖车； Ter，终结者； TEV，烟草蚀刻病毒； LB，左边界序列； RB，右边界序列。（c）通过烟草本尼亚娜（Nicotiana Benthamiana）的MMV救援程序的例证，并转移到玉米和Peregrinus Maidis Planthoppers。dpi，接种后天。图1C：使用biore nder.com
种系PTEN基因型依赖性表型差异在前脑机体的早期神经发育过程中
使用10倍基因组学铬单细胞3'试剂盒（版本3.1），每个样品捕获了6,000至10,000个细胞以进行库和测序生成。在器官解离，单细胞悬浮液，凝胶珠和乳液油被添加到10x基因组单细胞芯片G中。在液滴产生后，将样品转移到PCR 8管条（USA Scientific）中，使用SimpleiaMp热循环液（Appliam appliiamp appliamp cyscler（USA Scientific）进行反转录反应（USA Scientific）。cDNA。根据10倍基因组用户指南，使用Silane Dynabead清理cDNA。将纯化的cDNA放大了11个循环，然后使用spriselect珠
散装RNA-seq教学手册
批量RNA-seq教学手册本手册的目的是为蒙大拿州立大学研究人员提供实用指南，以执行散装RNA-Seq。作者：蒙大拿州立大学的微生物学和细胞生物学系Dana Rashid为本手册提供了资金，由NSF EPSCOR Grant＃2229308提供。I.简介页＃什么是散装RNA-Seq？2可以用散装RNA-seq研究什么？2限制3个散装RNA-seq与PCR阵列3个散装RNA-SEQ与单细胞RNA-Seq 3转录组覆盖范围，具有不同的Illumina平台4 II。样品制备和cDNA库的生产数量的每个样品4初始样品制备5-6评估RNA产量和质量6-7 mRNA富集与rRNA耗竭7的产生cDNA库7-8 cDNA库库测序8-10 III。生物信息学原始测序数据处理10参考库对齐10块RNA-seq数据分析10-主成分分析10-11差分基因表达分析11-13 MSU内部程序，并与外部设施14 IV接口。设备和供应设备和供应设备用于细胞分类14的RNA提取15用于测序15计算机要求15的cDNA库15所需的RNA隔离供应15用于cDNA生产15 V.联系信息16 VI。协议协议＃1。从鸡盘软骨中隔离的RNA 17-18方案＃2。从斑马鱼胚胎19-20 VII中分离出RNA。 参考21从斑马鱼胚胎19-20 VII中分离出RNA。参考21
RNA 测序中逆转录反应的伪影和偏差
近年来，RNA 测序激发了大量的研究领域。大多数方案依赖于在逆转录反应过程中合成更稳定的 RNA 分子互补 DNA (cDNA) 拷贝。结果 cDNA 池经常被错误地认为在数量和分子上与原始 RNA 输入相似。遗憾的是，偏差和伪影会混淆结果 cDNA 混合物。依赖逆转录过程的人们在文献中经常忽视或忽略这些问题。在这篇评论中，我们向读者展示了 RNA 测序实验过程中逆转录反应引起的样本内和样本间偏差和伪影。为了打消读者的疑虑，我们还提供了大多数问题的解决方案并介绍了良好的 RNA 测序实践。我们希望读者能够利用这篇评论，从而为科学合理的 RNA 研究做出贡献。
Rhapsody™系统-TCR/BCR接下来，目标mRNA，...
用BD®ABSEQ和样品TAG抗体染色细胞以及细胞的分配和裂解后，将cDNA用作为模板的转录本的3'和5'端在BD Rhapsody™增强细胞捕获珠上编码。然后，使用两步的嵌套扩增从这些孔cDNA库中扩增 mRNA，TCR和BCR库，其中TCR和BCR库进行了其他随机启动，以捕获互补性确定区域（CDR）1、2和3，以及框架区域（FR）1-4。bd®Abseq和样品标签库是从珠子变性的上清液中放大的。