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第 2 部分：RNA 处理
现在，您一定已经熟悉了真核生物的蛋白质编码基因指导相应 RNA 分子合成的过程。这个过程称为转录，发生在原核生物和真核生物中。原核生物中的过程更简单。原核生物只有一种 RNA 聚合酶，负责合成 mRNA 以及所有其他类型的 RNA 分子。此外，刚刚合成的 mRNA 能够指导蛋白质合成，因为细菌 mRNA 不需要进一步处理即可翻译。另一方面，真核生物有三种不同类型的 RNA 聚合酶，真核 mRNA 的合成由 RNA 聚合酶 II 催化，使用 dsDNA 的一条链作为模板。这个过程发生在细胞核中，由此产生的 RNA 分子被称为 hnRNA（异质核 RNA），因为它们
Addgene's CRISPR 101电子书，第三版
2。在有指导RNA的情况下与靶DNA结合，只要目标是原始的邻接基序的上游（5'），GRNA和cas9核酸内切酶都会形成Cas9：GRNA复合物。cas9核酸内切酶与靶基因组基因核基因座结合均由导向RNA中包含的靶序列介导，又介导了一个3碱基对序列，称为原始序列相邻基序或PAM。为了通过CAS9切割DsDNA，它必须立即包含由导向RNA靶向的位点下游（3'）的PAM序列。在没有引导RNA或PAM序列的情况下，CAS9既不会结合也不会切割目标。Cas9同源物（请参见下表）具有不同的PAM要求。这些不同的PAM要求使研究人员能够针对许多不同的基因组基因座。
自适应细菌免疫中的可编程双 RNA 引导 DNA 内切酶
成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关 (Cas) 系统通过使用 CRISPR RNA (crRNA) 引导入侵核酸的沉默，为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的适应性免疫。我们在此表明，在这些系统的一个子集中，与反式激活 crRNA (tracrRNA) 碱基配对的成熟 crRNA 形成双 RNA 结构，该结构指导 CRISPR 相关蛋白 Cas9 在靶 DNA 中引入双链 (ds) 断裂。在与 crRNA 引导序列互补的位点，Cas9 HNH 核酸酶结构域切割互补链，而 Cas9 RuvC 样结构域切割非互补链。当双 tracrRNA:crRNA 被设计为单 RNA 嵌合体时，它还会指导序列特异性 Cas9 dsDNA 切割。我们的研究揭示了一个使用双 RNA 进行位点特异性 DNA 切割的核酸内切酶家族，并强调了利用该系统进行 RNA 可编程基因组编辑的潜力。B
铜（II）肽螺旋在哺乳动物细胞中选择性切割DNA复制灶
体外和在哺乳动物细胞中的DNA复制灶。这是实现此类城市的第一次。3WJ是最简单的分支DNA结构，14由由三个收敛的dsDNA单元形成的对称组件组成，它们在一个称为分支点的中心点相遇，该单位形成了直径约为12Å的直径约为12Å，由三个B-DNA Arm臂的终端底座对de de de ned。15属金属分子螺旋螺旋物是选择性识别这些非规范性DNA结构的最合理的药物。6 - 12其选择性的关键因素之一是它们的形状与3WJ的分支点的三角对称性之间的高互补性。的确，这是其他3WJ粘合剂的关键结构特征，例如三联烯衍生物，16 C 3-对称阳离子azacryptands，17个自组装超分子超分子Fe II四面体金属金属18和3倍对称三倍的三肽。19
2′-O-甲基修饰的向导RNA增强CRISPR-Cas12a系统的单核苷酸多态性(SNP)鉴别能力
成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白是细菌和古菌所特有的，构成了针对外来移动遗传元素的适应性免疫系统。1,2 CRISPR-Cas 系统分为第 1 类（使用多个 Cas 蛋白）和第 2 类系统（使用单个多结构域 Cas 蛋白），根据复杂性和特征蛋白又细分为六种类型（I 型至 VI 型）。3 作为第 2 类系统的成员，II-A 型 CRISPR-Cas9 得到了最广泛的研究和开发，成为基因组编辑和治疗工具。 4 Cas9 具有两个核酸酶位点——His – Asn – His (HNH) 和 RuvC 样结构域，可在双 CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 crRNA (transcrRNA) 向导介导的特定位点实现双链 DNA (dsDNA) 的精确切割。5,6
![b'sandwich排列，其中包含捕获目标 - 信号探针。随后通过监测被观察到的甲基蓝（MB）的峰值电流变化来检测到所得的DNA杂交事件，该脉冲伏安法（DPV）被用作氧化还原物种的峰值电流变化，并实现了35 AM的检测极限。 Wang等。 [5]开发了一种基于RGO和锰四苯基 - 苯基苯基苯基二磷酸结构的自组装纳米复合材料的DNA生物传感器，从而导致6 \ XC3 \ X9710 14 M.的检测极限。 [6]采用了由捕获DNA序列组成的转换界面，在玻璃碳电极上官能化RGO，以构造无标记的DNA生物传感器，并达到了4.28 \ XC3 \ X9710 19 M.的检测极限。 Chen等。 [7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。 DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。周等人。 [8]使用化学的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记的电化学检测进行了无标记的电极。他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。在另一个](/simg/g:\will\search\icon\source\9\95e0d0afb2a6a7d5d7547557c83da02f0068910b.webp)
b'sandwich排列，其中包含捕获目标 - 信号探针。随后通过监测被观察到的甲基蓝（MB）的峰值电流变化来检测到所得的DNA杂交事件，该脉冲伏安法（DPV）被用作氧化还原物种的峰值电流变化，并实现了35 AM的检测极限。 Wang等。 [5]开发了一种基于RGO和锰四苯基 - 苯基苯基苯基二磷酸结构的自组装纳米复合材料的DNA生物传感器，从而导致6 \ XC3 \ X9710 14 M.的检测极限。 [6]采用了由捕获DNA序列组成的转换界面，在玻璃碳电极上官能化RGO，以构造无标记的DNA生物传感器，并达到了4.28 \ XC3 \ X9710 19 M.的检测极限。 Chen等。 [7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。 DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。周等人。 [8]使用化学的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记的电化学检测进行了无标记的电极。他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。在另一个
b'sandwich排列，其中包含捕获目标 - 信号探针。随后通过监测观察到的亚甲基蓝（MB）的峰值电流变化来检测所得的DNA杂交事件，该峰值电流变化被用作氧化还原物种，并实现了35 AM的检测极限。Wang等。 [5]基于RGO和锰四苯基孢子的A \ XCF \ X80-偶联结构的自组装纳米复合材料开发了DNA生物传感器，导致6 \ xc3 \ x9710 14M的检测极限，在另一项研究中，在另一项研究中，Ye等。 [6]采用了一个转导界面，该界面由捕获的DNA序列，Aunps和Thionines在玻璃碳电极上官能化RGO来构建无标记的DNA生物传感器，并获得了4.28 \ xc3 \ x9710 199的检测极限。 Chen等。 [7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。 DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。 Zhou等。 [8]使用化学上的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记电化学检测进行了。 他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。 在另一项研究中，Zhang等人。 [9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。Wang等。[5]基于RGO和锰四苯基孢子的A \ XCF \ X80-偶联结构的自组装纳米复合材料开发了DNA生物传感器，导致6 \ xc3 \ x9710 14M的检测极限，在另一项研究中，在另一项研究中，Ye等。[6]采用了一个转导界面，该界面由捕获的DNA序列，Aunps和Thionines在玻璃碳电极上官能化RGO来构建无标记的DNA生物传感器，并获得了4.28 \ xc3 \ x9710 199的检测极限。Chen等。 [7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。 DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。 Zhou等。 [8]使用化学上的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记电化学检测进行了。 他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。 在另一项研究中，Zhang等人。 [9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。Chen等。[7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。Zhou等。 [8]使用化学上的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记电化学检测进行了。 他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。 在另一项研究中，Zhang等人。 [9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。Zhou等。[8]使用化学上的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记电化学检测进行了。他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。在另一项研究中，Zhang等人。 [9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。在另一项研究中，Zhang等人。[9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。将DNA固定在用石墨烯，Aunps和Polythionine（Pthion）修饰的玻璃碳电极上。通过不同的脉冲伏安法检测到杂交，并且在0.1 pm至10 nm的动态范围内达到了35 fm的检测极限。Bo等人开发了石墨烯和聚苯胺的电化学DNA生物传感器。[10]用于DPV检测辅助DNA序列，并达到了'
从DNA构造到1天的蛋白质
图2。吉布森组装反应效率和准确性对反应时间的依赖性。（a）与吉布森组装反应混合物转化的大肠杆菌菌落形成的比较。数据代表具有标准偏差的平均CFU计数（n = 9）。（b）RCA反应使用吉布森组装克隆产物作为模板产生。使用Quant-IT PICOGREEN DSDNA测定试剂盒对反应产量进行定量。数据表示标准偏差（n = 3）的平均值。（c）使用插入片段侧面的载体特异性引物对大肠杆菌转化体进行群落PCR筛选。用SYBR安全染料将等量的PCR产物加载在1％的E-E-Gel琼脂糖凝胶上。m：e-gel 1 kb Plus Express DNA梯子用作分子大小标准，NC：由无插入的矢量组成的负对照，NTC：非板块对照。
CAS12A的反式DNA裂解活性没有可检测到的免疫力对质粒或噬菌体
CAS12A是V-A型CRISPR-CAS RNA引导的内切酶。它在特定位点切割了dsDNA，然后在体外反式跨体内激活以非特征ssDNA的裂解。反式活性的免疫功能仍然未知。为了解决这个问题，我们在大肠杆菌中构建了一个CAS12A靶向系统，其中CAS12A裂解了高拷贝靶质粒以释放反式ssDNA裂解活性。然后，我们分析了Cas12a靶向对非目标质粒和ssDNA噬菌体的影响。结果表明，CAS12A有效地消除了目标质粒，但对噬菌体的非目标质粒或鼠疫形成的维持没有影响。此外，有助于靶质粒耗竭的两间隔crispr阵列仍然对非目标质粒或噬菌体没有可检测的影响。一起，数据表明CAS12A的反式ssDNA切割不会导致体内免疫力。
可编程双 RNA 引导的 DNA 内切酶...
成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关 (Cas) 系统通过使用 CRISPR RNA (crRNA) 引导入侵核酸的沉默，为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的适应性免疫。我们在此表明，在这些系统的一个子集中，与反式激活 crRNA (tracrRNA) 碱基配对的成熟 crRNA 形成双 RNA 结构，该结构指导 CRISPR 相关蛋白 Cas9 在靶 DNA 中引入双链 (ds) 断裂。在与 crRNA 引导序列互补的位点，Cas9 HNH 核酸酶结构域切割互补链，而 Cas9 RuvC 样结构域切割非互补链。当双 tracrRNA:crRNA 被设计为单 RNA 嵌合体时，它还会指导序列特异性 Cas9 dsDNA 切割。我们的研究揭示了一个使用双 RNA 进行位点特异性 DNA 切割的核酸内切酶家族，并强调了利用该系统进行 RNA 可编程基因组编辑的潜力。B