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癌症中的基因组编辑
基因组编辑是一种利用工程核酸酶在特定基因组位置诱导双链断裂 (DSB) 的方法，以便利用细胞内源性 DNA 修复机制引入基因组修饰 [ 1 , 2 ]。DSB 形成后，细胞将利用两种修复机制中的一种——非同源末端连接 (NHEJ) 和同源性依赖性修复 (HDR)，这两种机制均可用于诱导 DNA 变化 [ 3 , 4 ]。在 NHEJ 过程中，细胞将 DNA 的断裂末端重新连接在一起——这个过程很快但往往不准确，修复后的链通常包含小的突变，表现为小的缺失和插入 [ 5 , 6 ]。在基因组编辑中，NHEJ 用于通过功能丧失突变来灭活基因功能。HDR 是一个更复杂的过程，需要供体 DNA 与断裂的两侧都具有同源性。在 HDR 中，细胞处理 DSB 的末端，留下 3′突出端，这些突出端侵入供体 DNA 的同源位点，将其用作 DNA 合成的模板，从而纠正断裂并使其与供体 DNA 相同 [7]。虽然在自然界中，供体 DNA 是姐妹染色单体，但在基因组编辑中，外源 DNA 被引入细胞，作为模板，将所需的变化引入基因组 [8]（图 1）。多年来，已有多种类型的工程核酸酶被用于诱导基因组编辑所需的 DSB，包括
经典和替代最终连接的不足
在真核生物中，双链断裂（DSB）可以通过同源重组（HR）或非同源最终连接（NHEJ）修复。在体细胞中，人力资源非常不具体。因此，绝大多数DSB通过NHEJ的两种不同途径进行修复。经典（CNHEJ）途径取决于het-rodimer ku70/ku80，而聚合酶theta（polq）（polq）是替代（anhej）途径的核心。令人惊讶的是，即使两种途径受损，拟南芥植物也是可行的。但是，它们表现出严重的生长迟缓和生育能力降低。有丝分裂过轴酶的分析表明，双突变体的特征是由于DSB修复缺陷而导致染色体碎片的急剧增加。与单个突变体相反，发现双突变体对诱导DSB的基因毒素博来霉素高度敏感。因此，这两种途径都可以在DSB修复中相互补充。我们推测，在没有NHEJ途径的情况下，HR可能会增强。这对于基因靶向（GT）特别有吸引力，其中使用同源模板引入了预定的变化。不期望的是，与野生型植物相比，POLQ单突变体和双突变体的GT频率明显较低。因此，我们能够证明消除两种NHEJ途径并不对农业介导的GT构成有吸引力的方法。但是，我们的结果清楚地表明，CNHEJ的损失导致GT频率的增加，这对于使用Planta GT策略的实践应用特别有吸引力。
CRISPR/Cas9 切割的 TP53 依赖性毒性在不同的基因组位点存在差异，并且可能会影响基因筛查
CRISPR/Cas9 基因编辑可以精确地灭活基因。该过程涉及 DNA 双链断裂 (DSB)，这可能导致细胞适应性丧失。我们假设 DSB 毒性可能因目标基因座中的染色质环境而异。在这里，通过分析同源细胞系对 CRISPR 实验以及来自约 900 个细胞系的先前筛选数据，我们发现 TP53 相关的断裂毒性在含有活性染色质的基因组区域（例如基因调控元件或转录延长组蛋白标记）中更高。DSB 修复途径选择和 DNA 序列环境也与毒性有关。我们还表明，由于 sgRNA 靶向位点的差异毒性引入了噪声，在 TP53 野生型细胞中，基因筛选检测条件必需性的能力降低。了解 Cas9 切割毒性的决定因素将有助于改进 CRISPR 试剂的设计，以避免偶然选择 TP53 缺陷和/或 DNA 修复缺陷的细胞。
CRISPR/CAS9技术在永生化的人类细胞系中的单基因编辑策略
摘要CRISPR/CAS9系统的使用在过去几年中迅速增长。在这里，描述了在人类非机智的体细胞系（NTHY-ORI）中的单核苷酸多态性的优化，突出了以克服有关递送和脱靶的问题的策略。，我们同时使用慢病毒和化学脂质作为递送剂以及两种创建双链断裂（DSB）的策略。前者通过经典的Cas9核酸酶（标准策略）诱导了DSB，而第二个则采用了修改后的CAS9产生单链破裂（SSB）。使用单链供体寡核苷酸或HR410-PA供体矢量（HR）进行敲门。可以通过将双镍酶系统与HR载体化学转染相结合来获得所需的细胞。此结果可能是由于DSB的类型造成的，这可能主要是由于Blunt（标准策略）和伸出时HR（Double Nickase）时的非同源末端连接而进行的。我们的结果表明，双镍酶适合在永生的NTHY-ORI细胞系中敲门，而标准CRISPR/ CAS9系统适合在/ DEL突变中创建基因敲除基因敲除。
p120 HDR 质粒 (h): sc-400943-HDR
含有由 CRISPR/Cas9 系统产生的双链断裂 (DSB) 的 DNA 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 途径进行修复 (1,2,3)。NHEJ 修复途径在切割位点引入非特异性插入或缺失，而 HDR 途径允许在 DSB 位点进行精确的基因编辑 (1,2,3)。靶向特异性 HDR 质粒为 DSB 提供 DNA 修复模板，当与 CRISPR/Cas9 KO 质粒共转染时，能够在发生 Cas9 诱导的 DNA 切割的位置插入特定的选择标记 (1,2)。HDR 质粒可以整合红色荧光蛋白 (RFP) 基因以直观地确认转染，并整合抗生素抗性基因 (嘌呤霉素) 以选择含有成功 CRISPR/Cas9 双链断裂的细胞。嘌呤霉素抗性和 RFP 编码基因两侧是两个 LoxP 位点，这些位点可被 Cre 载体识别，之后可利用该位点从基因组 DNA 中去除这些选择标记 (4,5)。
DNA 损伤和修复的原因和后果
摘要：无法修复受损的 DNA 会严重损害任何生物体的完整性。在真核生物中，DNA 损伤反应 (DDR) 在细胞核内以非随机方式在染色质（一种紧密组织的 DNA-组蛋白复合物）中起作用。因此，染色质会协调各种细胞过程，包括修复。在这里，我们检查 DNA 损伤之前、期间和之后的染色质状况，重点关注双链断裂 (DSB)。我们研究染色质在修复过程中是如何被修改的，不仅在受损区域周围（顺式），而且在全基因组范围内（反式）。最近的证据突出了一个复杂的状况，其中不同的染色质参数（硬度、压缩度、环）被暂时修改，为 DDR 的每个特定阶段定义“代码”。我们说明了 DDR 的一个新颖的方面，其中染色质修饰有助于 DSB 损伤染色质以及未损伤染色质的移动，从而确保 DSB 的动员、聚集和修复过程。
教授亚历克西斯·科莫尔
摘要：在 2016 年碱基编辑技术发展之前，基因组编辑技术通过在目标基因组位点引入双链 DNA 断裂 (DSB) 作为基因组编辑的第一步来发挥作用。这通常使用 Cas9（一种可编程的核酸内切酶）和一段称为向导 RNA (gRNA) 的 RNA 来实现，该 RNA 编码了 Cas9 将使用简单的 Watson-Crick-Franklin 碱基配对规则结合和切割的基因组位置。DSB 的细胞处理会产生多种基因组编辑产物，包括精确编辑结果以及插入和删除 (indel) 副产物。自 1990 年代基因组编辑领域成立以来，indel 与精确产物的高频率一直是该领域的长期挑战。在这里，我将介绍我的实验室为开发具有更高效率和精度的新基因组编辑方法所做的努力。其中包括开发新的碱基编辑器（BE）工具，以及提高依赖 DSB 方法的精度的新方法。
DNA修复的全基因组分析标识更高 -
（a）实验设置和集成的概述。（b）1p染色体上的信号。左：在 +DSB条件下的单细胞热图（RPKM），其顶部为 +DSB（有色）和–DSB（灰色）条件的单细胞聚集体。右：带有覆盖MSR调用的单细胞线图。asisi主题用黑线注释，红色三角形表示经常裂解（或“顶部”）位点。（c）所有修复频率≥10％的ASISI位点的条形图，每个位点的修复频率（目标蛋白质和方法）颜色为颜色。通过增加绝对修复频率（即任何数据集中的最高频率）来订购（在X轴上）。每个站点，通过增加每个数据集的维修频率（前后；即未堆叠栏）来排序条。底部水平条表示先前的（缺乏）注释作为顶部位点。（d）一个代表性核的共聚焦图像显示DAPI，RAD51 DAMID M6 A-TRACER和内源性γH2AX免疫荧光染色。（e）信号共定位（Manders的A和B每个核）的定量，n = 33核。
全基因组的DNA修复蛋白分析鉴定单细胞中的高阶配位
a，实验设置和集成的概述。b，染色体1p上的信号。左：在 +DSB条件下的单细胞热图（RPKM），其顶部为 +DSB（有色）和–DSB（灰色）条件的单细胞聚集体。右：带有覆盖MSR调用的单细胞线图。asisi图案，用黑线注释，红色三角形表示经常裂解（或“顶部”）位点。c，所有ASISI位点的条形图≥10％，每个位点的修复蛋白频率（靶蛋白和方法）都有颜色。通过增加绝对修复蛋白频率（即，任何数据集中的最高频率）。每个站点，通过增加每个数据集的修复蛋白频率（即前后；即未堆叠）来排序条。底部水平条表示先前的（缺乏）注释作为顶部位点。d，一个代表性核的共聚焦图像，显示DAPI，RAD51 DAMID M6A-Tracer和内源性γH2AX免疫荧光染色。e，信号共定位的定量（manders的a和a和b每个核），n = 33核。