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用脱氨酶替换 SpCas9 HNH 结构域可生成具有替代靶向范围的紧凑型碱基编辑器
碱基编辑器是 RNA 引导的脱氨酶，可实现位点特异性核苷酸转换。这些 Cas 脱氨酶融合蛋白的靶向范围主要取决于靶基因座处原间隔区相邻基序 (PAM) 的可用性，并且仅限于 CRISPR-Cas R 环内的窗口，其中单链 DNA (ssDNA) 可供脱氨酶接触。在这里，我们推断 Cas9-HNH 核酸酶结构域在空间上限制了 ssDNA 的可及性，并证明省略该结构域会扩大编辑窗口。通过将 HNH 核酸酶结构域与单体或异二聚体腺苷脱氨酶交换，我们还设计了具有 PAM 近端移位编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器变体 (HNHx-ABE)。这项工作扩展了碱基编辑器的靶向范围，并提供了明显更小的碱基编辑器变体。此外，它还提供了 Cas9 蛋白质工程的未来潜在方向，其中 HNH 结构域可以被作用于 ssDNA 的其他酶取代。
2024 年 8 月 26 日注意：Kaden Energy 的债权人......
如果在债权人会议开始时或之前未作出任何选择（通过在此处提供的选择表上选择已选便利类别、立即付款选择、12 个月付款选择或 24 个月付款选择并提交给提案受托人），则您将被视为已选择 12 个月付款选择。联系信息和所需表格的提交您可以通过电子邮件向 Sahib Singh（sahsingh@bdo.ca）或传真向 403-233-7833 向受托人提交投票信函、代理表格和/或选举信函（如适用）。我们强烈建议您尽快将这些文件提交给我们的办公室，以便在债权人会议前有足够的时间进行审查，但是，您必须在会议开始前提交这些文件，以便参与对提案的投票和根据提案作出选择。如对此事有任何疑问，请联系上述各方。此致，BDO Canada Limited 以 Kaden Energy Ltd. 的提案受托人身份，而非以个人身份 原因：
具有最小基因组错误的工程化主要编辑器
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2024 年 8 月 3 日发布。；https://doi.org/10.1101/2024.08.02.606370 doi：bioRxiv 预印本
通过模拟 CRISPR-Cas 序列来设计高功能基因组编辑器
基因编辑有可能解决农业、生物技术和人类健康领域的基本挑战。源自微生物的基于 CRISPR 的基因编辑器虽然功能强大，但在移植到非原生环境（例如人类细胞）时通常会表现出显著的功能权衡。人工智能 (AI) 支持的设计提供了一种强大的替代方案，有可能绕过进化限制并生成具有最佳属性的编辑器。在这里，使用在大规模生物多样性上训练的大型语言模型 (LLM)，我们展示了首次使用 AI 设计的可编程基因编辑器成功精确编辑人类基因组。为了实现这一目标，我们通过系统地挖掘 26 兆碱基的组装基因组和元基因组，整理了超过一百万个 CRISPR 操纵子的数据集。我们通过生成自然界中发现的 CRISPR-Cas 家族中 4.8 倍的蛋白质簇数量并为 Cas9 样效应蛋白定制单向导 RNA 序列来展示我们模型的能力。生成的几个基因编辑器与 SpCas9（典型的基因编辑效应器）相比，表现出相当或更好的活性和特异性，同时在序列上相差 400 个突变。最后，我们展示了一个 AI 生成的基因编辑器，称为 OpenCRISPR-1，它表现出与碱基编辑的兼容性。我们公开发布 OpenCRISPR-1，以促进在研究和商业应用中广泛、合乎道德的使用。
基因组编辑器的体内靶向非病毒递送
RNA 引导的 CRISPR-Cas 酶因其功效、灵活性和易用性而被广泛用于基因组编辑 [已在其他地方进行综述 (1, 2)]。虽然 Cas9 等 CRISPR 蛋白已经在临床试验中显示出良好的前景，但对人类基因组造成永久性改变的现实意味着安全性至关重要。在基因组层面，Cas9 的特异性已通过预测脱靶位点的方法 (3, 4) 和分子工程来产生高保真度蛋白质 (5) 进行了优化。然而，一项将提高基因组编辑的实用性和安全性的关键发展是能够将 CRISPR-Cas 基因组编辑机制专门递送到患者体内所需的细胞类型、组织或器官。对于许多遗传疾病，只有一小部分细胞或特定器官表现出疾病的表型迹象，因此将成为基因组编辑的预期目标。对非预期细胞或器官进行基因组编辑可能会增加意外治疗结果的风险，此外还会因更高的剂量要求而增加制造成本。目前，CRISPR-Cas 基因组编辑器的靶向递送仍然是成功实现基因组编辑临床转化的重要未满足需求。病毒载体缺乏其天然基因组和复制能力，是基因治疗和最近的 CRISPR-Cas 基因组编辑的一种有吸引力的递送策略[在其他地方进行了综述 (6)]。最广泛使用的病毒载体是逆转录病毒和腺相关病毒 (AAV) (7, 8)。慢病毒载体是逆转录病毒的一个亚型，在基因组整合后表达较大的转基因 (~ 10 kb)，而 AAV 表达较小的转基因 (~ 4.7 kb)，来自长寿命的附加体；这两种病毒载体都能够转导分裂细胞和非分裂细胞。假型慢病毒载体 (9)、新 AAV 趋向性工程 (10) 和组织特异性启动子使用的进展使得这些技术能够实现细胞特异性递送。然而，病毒递送也引入了
基因组编辑器的体内靶向非病毒递送
RNA 引导的 CRISPR-Cas 酶因其功效、灵活性和易用性而被广泛用于基因组编辑 [已在其他地方进行综述 (1, 2)]。虽然 Cas9 等 CRISPR 蛋白已经在临床试验中显示出良好的前景，但对人类基因组造成永久性改变的现实意味着安全性至关重要。在基因组层面，Cas9 的特异性已通过预测脱靶位点的方法 (3, 4) 和分子工程来产生高保真度蛋白质 (5) 进行了优化。然而，一项将提高基因组编辑的实用性和安全性的关键发展是能够将 CRISPR-Cas 基因组编辑机制专门递送到患者体内所需的细胞类型、组织或器官。对于许多遗传疾病，只有一小部分细胞或特定器官表现出疾病的表型迹象，因此将成为基因组编辑的预期目标。对非预期细胞或器官进行基因组编辑可能会增加意外治疗结果的风险，此外还会因更高的剂量要求而增加制造成本。目前，CRISPR-Cas 基因组编辑器的靶向递送仍然是成功实现基因组编辑临床转化的重要未满足需求。病毒载体缺乏其天然基因组和复制能力，是基因治疗和最近的 CRISPR-Cas 基因组编辑的一种有吸引力的递送策略[在其他地方进行了综述 (6)]。最广泛使用的病毒载体是逆转录病毒和腺相关病毒 (AAV) (7, 8)。慢病毒载体是逆转录病毒的一个亚型，在基因组整合后表达较大的转基因 (~ 10 kb)，而 AAV 表达较小的转基因 (~ 4.7 kb)，来自长寿命的附加体；这两种病毒载体都能够转导分裂细胞和非分裂细胞。假型慢病毒载体 (9)、新 AAV 趋向性工程 (10) 和组织特异性启动子使用的进展使得这些技术能够实现细胞特异性递送。然而，病毒递送也引入了
高性能 TadA-8e 衍生的胞嘧啶和双碱基编辑器，在植物中具有不可检测的脱靶效应
Tingting Fan 1,2Ɨ , Yanhao Cheng 3Ɨ , Yuechao Wu 4,5Ɨ , Shishi Liu 1Ɨ , Xu Tang 1,2Ɨ , Yao He 1 , Shanyue Liao 1 , Xuelian Zheng 1,2 ,Tao Zhang 4,5* , Yiping Qi 3,6* , Yong Zhang 2* 1 Department of Biotechnology, School of Life Sciences and Technology, Center for
基于 CRISPR 的基因组编辑器的药物输送系统
成熟和新兴的基因编辑器 CRISPR–Cas 系统是一种广泛存在的原核生物防御系统，用于防御入侵的噬菌体和外来遗传物质。在自然界中，它们由 (1) 效应模块（在第 1 类 CRISPR 系统中是蛋白质复合物，在第 2 类 CRISPR 系统中是单个效应子）和 (2) 适应模块（将外来序列整合到 CRISPR 阵列中，crRNA 从中表达）组成。由于这些系统是 RNA 引导的，因此可以通过改变 crRNA 的序列重新定位它们，这为可编程基因组编辑工具提供了一个起点，有关此类工具的开发已在其他地方进行了综述 5 – 13 。第一个被设计用于人类细胞的系统是 2 类 CRISPR–Cas9 系统 14、15，其中化脓性链球菌 CRISPR–Cas9 系统 (SpCas9；也简称为 Cas9) 是目前使用最广泛的系统。Cas9 在与向导 RNA（对于 Cas9 来说称为单向导 RNA (sgRNA)）互补的靶位点处产生双链断裂 (DSB)；在人类细胞中，这些 DSB 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 修复，这一过程通常会导致基因功能丧失。早期临床数据 16 表明，NHEJ 介导的基因敲除会降低致病蛋白的表达（见相关链接）。靶向的 DSB 也可以通过宿主细胞的内源性同源修复机制进行修复，从而整合由 Cas9 和 gRNA 随附的外源提供的模板 DNA。 Cas9 已被改造以实现其他基因组结果。通过突变 SpCas9 的催化残基（参考文献 17），Cas9 可以转化为可编程的 DNA 结合蛋白，通常称为死 Cas9 (dCas9)。尽管单独使用 dCas9 可以通过阻止 RNA 聚合酶的通过来减少靶基因转录，但 dCas9 与转录抑制因子（例如 Krüppel 相关框结构域 18）或表观基因组修饰因子（例如 DNA 甲基化酶 DNMT3A 19、20）的融合已促成 CRISPR 干扰系统的产生。类似地，dCas9 可通过融合转录激活因子（如 VP64（参考文献 21））或表观基因组修饰因子（如人类乙酰转移酶 p300（参考文献 22）或 TET1 脱甲基酶 19、23）用于靶向转录激活。
关于编辑
Victor Hugo C. de Albuquerque博士（IEEE的高级成员）是Teleformatics Engineering（DETI）/研究生课程的教授兼高级研究员，远程信息技术工程（PPGETI）的研究生课程（UFC）（UFC）（UFC）。 他曾在Paraíba联邦大学（UFPB，2010年）获得机械工程博士学位，并获得了PPGETI/UFC（UFC，2007年）的Teleforformatics工程硕士学位。 他在联邦技术教育中心完成了机电一体化工程的BSE（Cefetce，2006年）。 他具有生物医学科学和工程的经验，主要在应用计算，智能系统以及可视化和互动的研究领域，对模式识别，人工智能，图像处理和分析以及在生物信号处理，生物医学电路，生物医学电路和人类/人类/人类/人类/人类的互动和诸如动物的模型和美德的兴趣，以及生物信号处理，生物医学电路和人类脑电图和美德。 Victor教授是巴西生物医学工程学会（SBEB）的正式成员。 He is Editor-in-Chief of the Journal of Artificial Intelligence and Systems and Journal of Biological Sciences , as well as Associate Editor of the IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics , Computers in Biology and Medicine , Frontiers in Cardiovascular Medicine , Computational Physiology and Medicine , Applied Soft Computing , IEEE Access , Frontiers in Communications and Networks , Computational Intelligence and Neuroscience , Measurement , IET Quantum 沟通 。Victor Hugo C. de Albuquerque博士（IEEE的高级成员）是Teleformatics Engineering（DETI）/研究生课程的教授兼高级研究员，远程信息技术工程（PPGETI）的研究生课程（UFC）（UFC）（UFC）。他曾在Paraíba联邦大学（UFPB，2010年）获得机械工程博士学位，并获得了PPGETI/UFC（UFC，2007年）的Teleforformatics工程硕士学位。他在联邦技术教育中心完成了机电一体化工程的BSE（Cefetce，2006年）。他具有生物医学科学和工程的经验，主要在应用计算，智能系统以及可视化和互动的研究领域，对模式识别，人工智能，图像处理和分析以及在生物信号处理，生物医学电路，生物医学电路和人类/人类/人类/人类/人类的互动和诸如动物的模型和美德的兴趣，以及生物信号处理，生物医学电路和人类脑电图和美德。Victor教授是巴西生物医学工程学会（SBEB）的正式成员。He is Editor-in-Chief of the Journal of Artificial Intelligence and Systems and Journal of Biological Sciences , as well as Associate Editor of the IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics , Computers in Biology and Medicine , Frontiers in Cardiovascular Medicine , Computational Physiology and Medicine , Applied Soft Computing , IEEE Access , Frontiers in Communications and Networks , Computational Intelligence and Neuroscience , Measurement , IET Quantum 沟通 。此外，他曾是几本著名的期刊和许多国际会议的TPC成员的首席嘉宾编辑。
利用随机多路复用 sgRNA 组装碱基编辑器进行定向进化水稻基因
摘要 基于 CRISPR 的定向进化是一种有效的育种生物技术，可改善植物的农艺性状。然而，使用单个单向导 RNA 其基因多样化仍然有限。我们在这里描述了一种多重正交碱基编辑器 (MoBE) 和一种随机多重 sgRNA 组装策略，以最大化基因多样化。MoBE 可以在不同的靶标上有效诱导正交 ABE (< 36.6%)、CBE (< 36.0%) 和 A&CBE (< 37.6%)，而 sgRNA 组装策略将各种靶标上的碱基编辑事件随机化。对于水稻乙酰辅酶 A 羧化酶 (OsACC) 第 34 外显子的每一条链上的 130 个和 84 个靶标，我们在随机双 sgRNA 和随机三重 sgRNA 文库中观察到多达 27 294 种靶标-支架组合类型。我们进一步利用MoBE和随机双sgRNA文库对水稻中的OsACC进行了定向进化，获得了更强的除草剂抗性的单突变或连锁突变。这些策略可用于功能基因的原位定向进化，并可能加速水稻性状改良。