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使用内源性 U6 snRNA 启动子驱动的 CRISPR/Cas9 sgRNA 在核盘菌中进行有效的基因组编辑
我们之前报道了一种针对死体营养真菌植物病原菌核病菌的 CRISPR-Cas9 基因组编辑系统。该系统（TrpC-sgRNA 系统）基于 RNA 聚合酶 II（RNA Pol II）启动子（TrpC）在体内驱动 sgRNA 转录，成功创建了基因插入突变体。然而，相对低效率的靶向基因编辑阻碍了该方法在核病菌功能基因组研究中的应用。为了进一步优化 CRISPR-Cas9 系统，建立并评估了无质粒的 Cas9 蛋白/sgRNA 核糖核蛋白（RNP）介导的系统（RNP 系统）和基于质粒的 RNA 聚合酶 III 启动子（U6）驱动的 sgRNA 转录系统（U6-sgRNA 系统）。本研究针对之前鉴定的草酰乙酸乙酰水解酶 (Ssoah1) 基因座和一个编码聚酮化合物合酶 12 (Sspks12) 的新基因座创建了功能丧失突变体。RNP 系统与我们之前报道的 TrpC-sgRNA 系统类似，可以在 Ssoah1 基因座上以类似的效率产生突变。然而，这两个系统都未能在 Sspks12 基因座上成功产生突变。U6-sgRNA 系统在这两个基因座上都表现出明显更高的基因突变效率。该技术为靶向基因突变提供了一种简单有效的策略，从而将加快对这种具有重要经济价值的植物病原体的致病性和发展的研究步伐。
不耐受的不耐受性使有效的微生物单基因组编辑
摘要：CRISPR/CAS9系统最近已成为一种有用的基因特定编辑工具。然而，这种方法偶尔会导致由于不匹配耐受性而导致的DNA靶标和类似的DNA序列消化，这仍然是当前基因组编辑技术的显着缺点。但是，我们的研究确定，即使是靶DNA和5'截断的SGRNA之间的单基碱基不匹配也抑制了靶标识别。这些结果表明，5'截断的SGRNA/CAS9复合物可用于在微生物基因组中进行负选择单基本编辑的靶标。此外，我们证明了5'截断的SGRNA方法可用于简单有效的单基本编辑，因为它可以对DNA靶标的单个碱基进行修改，远离截短SGRNA的5'端。此外，当使用具有膨胀的原始探针邻近基序（PAM; 5'-NG）的工程Cas9核酸酶时，还允许5'截断的SGRNA进行有效的单基础编辑，这可以启用全基因组单基础量表。
优化 ABE 和 gRNA 以纠正 PiZ 突变……
在此工作过程中，腺嘌呤碱基编辑器被设计来纠正 SERPINA1 中致病的 PiZ 突变。由于关注点狭窄，优化的碱基编辑器不符合对 TadA* 脱氨酶变体或 spCas9 PAM 变体 3,4,5 的更一般建议。虽然精确纠正 PiZ 突变是最常见的编辑结果，但第二丰富的等位基因 (D341G A1AT) 表现出与野生型相当的分泌和弹性蛋白酶抑制特性。使用 LNP 递送技术，我们在 NSG-PiZ 转基因小鼠模型中评估了我们的碱基编辑方法。我们观察到平均 7 天时有益等位基因为 16.9%，3 个月时为 28.8%，此时接受治疗的动物血清 A1AT 水平相对于对照动物增加了 4.9 倍。弹性蛋白酶抑制能力的提高和单个 A1AT 亚型的质谱定量进一步证实了这一结果。肝脏病理也显著改善，测量结果显示 PAS-D 染色的 PiZ 小球减少。这些结果表明碱基编辑有可能解决 A1AT 缺乏症引起的肺病和肝病。
www.bio-protocol.org/e3796 基于双 sgRNA 的靶向...
请引用本文：Jin and Marquardt, (2020). 基于双 sgRNA 的大型基因组区域靶向缺失和拟南芥中可遗传的 Cas9 无突变体的分离, Bio-protocol 10 (20): e3796. DOI: 10.21769/BioProtoc.3796。
使用马铃薯 X 病毒载体中的非间隔 sgRNA 阵列工程进行高效的 Cas9 多重编辑
基于成簇、规则间隔、短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 的系统彻底改变了许多生物体（包括植物）的基因组编辑。植物中的大多数 CRISPR-Cas 策略依赖于使用农杆菌进行遗传转化来提供基因编辑试剂，例如 Cas 核酸酶或合成向导 RNA (sgRNA)。虽然 Cas 核酸酶是编辑方法中的恒定元素，但 sgRNA 是靶向特异性的，通常需要筛选过程来识别最有效的 sgRNA。植物病毒衍生载体是将 sgRNA 快速有效地递送到成年植物中的一种替代方法，因为病毒具有基因组扩增和系统运动的能力，这种策略称为病毒诱导的基因组编辑。我们对马铃薯病毒 X (PVX) 进行了改造，以构建一种可在成年茄科植物中轻松表达多个 sgRNA 的载体。使用基于 PVX 的载体，本氏烟基因被有效靶向，在组成性表达化脓性链球菌 Cas9 的转化株系中产生近 80% 的插入/缺失。有趣的是，结果表明 PVX 载体允许表达不间隔 sgRNA 阵列，在成年植物组织中几天内实现高效的多重编辑。此外，可以从受感染组织或受感染植物种子再生的植物中获得无病毒编辑的后代，这些后代表现出高遗传双等位基因突变率。总之，这种新的 PVX 载体可以轻松、快速和高效地表达 sgRNA 阵列以进行多重 CRISPR-Cas 基因组编辑，并将成为跨不同植物物种（尤其是茄科作物）进行功能基因分析和精准育种的有用工具。
将 dsDNA 与 ssDNA Oligo 和 NEBuilder HiFi DNA 组装连接起来，创建 sgRNA-Cas9 表达载体
摘要 本应用说明展示了将 sgRNA 序列插入 9.5 kb 载体进行靶向 DNA 组装的便利性。与必须合成并重新退火两个寡核苷酸的传统克隆方法不同，此新方案提供了一种简单的方法来设计寡核苷酸并将其与所需载体组装。NEBuilder HiFi DNA 组装主混合物比传统方法有了显著的改进，特别是在节省时间、易于使用和成本方面。
将 dsDNA 与 ssDNA Oligo 和 NEBuilder HiFi DNA 组装连接起来，创建 sgRNA-Cas9 表达载体
摘要 本应用说明展示了将 sgRNA 序列插入 9.5 kb 载体进行靶向 DNA 组装的便利性。与必须合成并重新退火两个寡核苷酸的传统克隆方法不同，此新方案提供了一种简单的方法来设计寡核苷酸并将其与所需载体组装。NEBuilder HiFi DNA 组装主混合物比传统方法有了显著的改进，特别是在节省时间、易于使用和成本方面。
将 dsDNA 与 ssDNA Oligo 和 NEBuilder HiFi DNA 组装连接起来，创建 sgRNA-Cas9 表达载体
摘要 本应用说明展示了将 sgRNA 序列插入 9.5 kb 载体进行靶向 DNA 组装的便利性。与必须合成并重新退火两个寡核苷酸的传统克隆方法不同，此新方案提供了一种简单的方法来设计寡核苷酸并将其与所需载体组装。NEBuilder HiFi DNA 组装主混合物比传统方法有了显著的改进，特别是在节省时间、易于使用和成本方面。
Cas9 蛋白和 gRNA 的电子圆二色谱
摘要：化脓性链球菌 Cas9 蛋白 (SpCas9) 是微生物中基于 CRISPR 的免疫系统的一个组成部分，已广泛用于基因组编辑。该核酸酶与向导 RNA (gRNA) 形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物，从而诱导 Cas9 结构变化并触发其切割活性。在这里，电子圆二色性 (ECD) 光谱用于确认 RNP 的形成并确定其各个组成部分。ECD 光谱具有区分 Cas9 和 gRNA 的特征，前者显示出负/正谱，最大值位于 221、209 和 196 nm，而后者显示出正/负/正/负模式，条带分别位于 266、242、222 和 209 nm。首次展示了 gRNA:Cas9 RNP 复合物的实验 ECD 光谱。它表现出双标记正/负 ECD 偶联，最大值位于 273 和 235 nm，并且与每个 RNP 成分的单独光谱有显著不同。此外，Cas9 蛋白和 RNP 复合物在 ECD 测量后仍保留生物活性，并且它们能够在体外结合和裂解 DNA。因此，我们得出结论，ECD 光谱可被视为一种快速且无损的方法，用于监测 Cas9 蛋白因 Cas9 和 gRNA 相互作用而发生的构象变化，以及鉴定 gRNA:Cas9 RNP 复合物。
通过裂域 CRISPR–Cas12a gRNA 开关进行序列独立的 RNA 传感和 DNA 靶向
CRISPR 技术越来越需要对核酸酶活性进行时空和剂量控制。一种有前途的策略是将核酸酶活性与细胞的转录状态联系起来，通过设计引导 RNA (gRNA) 使其仅在与“触发”RNA 复合后发挥作用。然而，标准的 gRNA 开关设计不允许独立选择触发和引导序列，从而限制了 gRNA 开关的应用。在这里，我们展示了 Cas12a gRNA 开关的模块化设计，它可以将这些序列的选择分离。Cas12a gRNA 的 5' 端融合到两个不同且不重叠的结构域：一个与 gRNA 重复碱基配对，阻止 Cas12a 识别所需的发夹结构的形成；另一个与 RNA 触发物杂交，刺激 gRNA 重复的重新折叠和随后的 gRNA 依赖性的 Cas12a 活性。使用无细胞转录翻译系统和大肠杆菌，我们表明设计的 gRNA 开关可以响应不同的触发因素并靶向不同的 DNA 序列。调节传感域的长度和组成会改变 gRNA 开关的性能。最后，可以设计 gRNA 开关来感知仅在特定生长条件下表达的内源性 RNA，从而使 Cas12a 靶向活性依赖于细胞代谢和压力。因此，我们的设计框架进一步使 CRISPR 活性与细胞状态挂钩。