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通过预复合的 CRISPR-Cas9/sgRNA 核糖核蛋白避开细胞抑制 RNA，实现高效的 ssODN 介导靶向
结合 CRISPR-Cas9 技术和单链寡脱氧核苷酸 (ssODN)，可以在诱导性多能干细胞 (iPSC) 中的目标基因组位点引入特定的单核苷酸改变；然而，与缺失诱导相比，ssODN 敲入频率较低。尽管已报道了几种 Cas9 转导方法，但是 CRISPR-Cas9 核酸酶在哺乳动物细胞中的生化行为仍有待探索。在这里，我们研究了影响 Cas9 体外裂解活性的内在细胞因素。我们发现细胞内 RNA（而不是 DNA 或蛋白质部分）会抑制 Cas9 与单向导 RNA (sgRNA) 结合并降低酶活性。为了防止这种情况，与 Cas9 过表达方法相比，在递送到细胞之前预复合 Cas9 和 sgRNA 可产生更高的基因组编辑活性。通过优化预复合核糖核蛋白和ssODN的电穿孔参数，我们实现了高达70%的单核苷酸校正效率和高达40%的loxP插入效率。最后，我们可以用C2等位基因替换HLA-C1等位基因，以生成组织相容性白细胞抗原定制编辑的iPSC。
优化ABE和GRNA以纠正G6PC-R83C突变
糖原储存疾病IA型（GSDIA）是由G6PC基因突变引起的常染色体隐性疾病，它破坏了葡萄糖稳态中的关键酶G6Pase 1。GSDIA患者患有低血糖，肝脏和肾脏的糖原和脂肪的积累，导致肝肿大和肾肿大。无法治愈。急性致命的低血糖，但肾脏疾病和肝细胞癌的长期并发症并未解决。与GSDIA相关的两个最普遍的G6PC突变是R83C和Q347X，均包含单个G> A的过渡突变。腺嘌呤碱基编辑器（ABES）可以使用基因组DNA中A•T到G•C的编程转换，并且原理可以用来精确纠正这些突变。在这里，我们设计了新颖的腺嘌呤基础编辑器（ABE）变体，以验证GSD1A的临床模型。
通过优化SGRNA ...
摘要aflysam/crispra系统最近已成为果蝇果蝇（Drosophila Melanogaster）的功能性研究的强大工具。该系统包括GAL4/UAS驱动的DCAS9激活剂和U6促进器控制的SGRNA。建立了超过其他组合的DCAS9激活剂，以进一步提高靶向激活剂的效率，我们系统地优化了SGRNA的参数。有趣的是，发现最有效的SGRNA在转录起始位点（TSS）上游的-150bp到-450bp的区域积累，并且激活效率显示与SGRNA靶向序列的GC含量的正阳性相关性很强。此外，目标区域主要是GC含量，因为SGRNA的靶向区域超过-600BP，即使含有75％的GC，TSS的SGRNA都会降低效率。令人惊讶的是，当将靶向sgrNA的活性与DNA链的活性进行比较时，靶向非模板链的SGRNA靶向均优于互补的模板链，无论是在细胞和体内。总而言之，我们定义了SGRNA设计的标准，这将极大地促进CRISPRA在功能奖励研究中的应用。
引文：Fan, R., Chai, Z., Xing, S., Chen, K., Qiu, F., Chai, T., Qiu, JL, Zhang, Z., Zhang, H., and Gao, C. (2020). 缩短 sgRNA-DNA 介
2018 ；Chen 等人，2017 ；Kleinstiver 等人，2016 ；Lee 等人，2018 ；Slaymaker 等人，2016）。增加和减少 sgRNA-DNA 界面的长度都会显著降低五种 Cas9 变体中的四种的编辑效率，Sniper-Cas9 是个例外（Lee et al., 2018）。但这种影响的基础尚不清楚。最近，Fu 等人观察到与靶标存在大量错配的 sgRNA 能够引导 SpCas9 切口双链 DNA（Fu et al., 2019）。同样，Szczelkun 等人描述了截短的 sgRNA（互补区为 ∆ 7 nt）与嗜热链球菌 Cas9 (StCas9) 结合导致缺口分子的积累 ( Szczelkun 等人，2014 )。这些观察结果表明，截短/延长的间隔区衍生片段对核酸酶的 HNH 和 RuvC 切割域施加了不同程度的影响，使得它们在某些情况下会切开目标 DNA，而不是将其切割。在这里，我们试图检验这一假设。
通过GFP-Reporter测定法恢复单切SGRNA的敏感且可靠的评估
大多数Duchenne肌肉营养不良（DMD）病例是由一个或多个外显子的删除或重复引起的，这些外显子破坏了DMD mRNA的阅读框架。恢复阅读框允许产生部分功能性肌营养不良蛋白，并导致症状不太严重。反义寡核苷酸介导的外显子跳过已被批准用于DMD，但是该策略需要重复治疗。crispr/cas9还可以恢复室内读取框架。尽管最近的体内研究表明单切换/外显子跳过策略的功效，但缺乏找到特定突变的最有效的单切SGRNA的方法。在这里，我们表明插入/删除（Indel）产生效率和Indel曲线都有助于读取框架恢复单切SGRNA的效率，因此只检查Indel频率的测定无法找到最佳的SGRNA。因此，我们开发了一种GFP重复蛋白测定法，以评估单切性效率，并报告了这两个方面的综合效应。我们表明，GFP-Reporter分析可以可靠地预测肌细胞中SGRNA的性能。此GFP-报告基因测定法可以有效，可靠地找到最有效的单切SGRNA来恢复肌营养不良蛋白的表达。
MultiCrispr：用于数千个目标的主要编辑和平行定位的GRNA设计
针对编码基因组通过CRISPR/ CAS9技术引入核苷酸缺失/插入已成为一种标准程序。它迅速产生了多种方法，例如素数编辑，顶点接近标记或同源性修复，但是，支持生物信息学工具的支持落后于此。新的CRISPR/CAS9应用程序通常会重新征询特定的GRNA设计功能，并且通常缺少一种通用工具。在这里，我们介绍了R/生物导体工具MulticRispr，旨在设计单个grnas和复杂的grna libraries。包装易于使用；在效率和特定的效率上，检测，分数和锻炼;每个目标或CRISPR/CAS9序列可视化和聚集结果；最后返回GRNA的范围和序列。是通用的，多晶状体定义的，并实现了基因组算术框架，作为便利适应最近引入的技术的基础，例如素数编辑或尚未出现。其性能和设计构想（例如目标集） - 特定过滤渲染多晶层在处理类似筛选的方法时选择的工具。
使用马铃薯 X 病毒载体中的非间隔 gRNA 阵列工程进行高效的 Cas9 多重编辑
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2020 年 6 月 26 日发布。；https://doi.org/10.1101/2020.06.25.170977 doi：bioRxiv preprint
合成SGRNA套件 - Net
请访问Synthego.com/Resources找到建议的转染协议。步骤4：分析敲除效率合成的推断CRISPR编辑（ICE）是一种免费的在线工具，可简单地使用Sanger序列数据对基因组编辑进行易于定量评估。该软件比较了从编辑和未编辑的细胞库中分离出的基因组DNA产生的扩增子的序列轨迹。该工具可在Ice.synthego.com上找到。基因组DNA制备，冰分析和克隆分离的方案可在Synthego.com/resources上获得。
SygRNA® 合成 gRNA 和 Cas9 蛋白
© 2020 德国达姆施塔特默克集团及其附属公司。保留所有权利。默克、充满活力的 M、SygRNA 和 Sigma-Aldrich 是德国达姆施塔特默克集团或其附属公司的商标。所有其他商标均为其各自所有者的财产。有关商标的详细信息可通过公开资源获取。
CRISPR-Cas9 介导的精准微生物基因组编辑，借助目标错配的 sgRNA
CRISPR-Cas9 系统彻底改变了基因组编辑。CRISPR-Cas9 由单分子向导 RNA (sgRNA) 和蛋白质 Cas9 核酸酶组成，后者可识别特定靶序列和原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列，然后切割目标 DNA 序列。该 CRISPR-Cas9 系统已被用作有效的负选择工具，用于在位点特异性诱变过程中切割未编辑或未改变的靶 DNA，从而获得具有所需突变的微生物细胞。本研究旨在调查 CRISPR-Cas9 系统在细菌体内寡核苷酸定向诱变中的基因组编辑效率。该系统成功地在大肠杆菌的 galK 中引入了 2 到 4 个碱基的突变，编辑效率很高 (81% − 86%)。然而，单点突变（T504A 或 C578A）很少引入，并且编辑效率非常低（<3％），这可能是由于错配耐受性所致。为了解决这个问题，我们在 sgRNA 序列中设计了一个或两个碱基的错配，以识别大肠杆菌中 galK 的靶序列。使用单碱基错配的 sgRNA，在 36％−95％ 的负向选择的大肠杆菌细胞中成功引入了单点核苷酸突变（galK 基因中的 T504A 或 C578A）。通过使用错配的 sgRNA 的全基因组单碱基编辑实验，随机选择了 16 个靶标。因此，在 48 个所需的单碱基突变中，使用错配的 sgRNA 成功编辑了 25 个单碱基。最后，为微生物基因组中的单核苷酸编辑提供了适用的靶标错配 sgRNA 设计规则。