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CRISPR-Cas9 系统彻底改变了基因组编辑。CRISPR-Cas9 由单分子向导 RNA (sgRNA) 和蛋白质 Cas9 核酸酶组成,后者可识别特定靶序列和原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列,然后切割目标 DNA 序列。该 CRISPR-Cas9 系统已被用作有效的负选择工具,用于在位点特异性诱变过程中切割未编辑或未改变的靶 DNA,从而获得具有所需突变的微生物细胞。本研究旨在调查 CRISPR-Cas9 系统在细菌体内寡核苷酸定向诱变中的基因组编辑效率。该系统成功地在大肠杆菌的 galK 中引入了 2 到 4 个碱基的突变,编辑效率很高 (81% − 86%)。然而,单点突变(T504A 或 C578A)很少引入,并且编辑效率非常低(<3%),这可能是由于错配耐受性所致。为了解决这个问题,我们在 sgRNA 序列中设计了一个或两个碱基的错配,以识别大肠杆菌中 galK 的靶序列。使用单碱基错配的 sgRNA,在 36%−95% 的负向选择的大肠杆菌细胞中成功引入了单点核苷酸突变(galK 基因中的 T504A 或 C578A)。通过使用错配的 sgRNA 的全基因组单碱基编辑实验,随机选择了 16 个靶标。因此,在 48 个所需的单碱基突变中,使用错配的 sgRNA 成功编辑了 25 个单碱基。最后,为微生物基因组中的单核苷酸编辑提供了适用的靶标错配 sgRNA 设计规则。

CRISPR-Cas9 介导的精准微生物基因组编辑,借助目标错配的 sgRNA

CRISPR-Cas9 介导的精准微生物基因组编辑,借助目标错配的 sgRNAPDF文件第1页

CRISPR-Cas9 介导的精准微生物基因组编辑,借助目标错配的 sgRNAPDF文件第2页

CRISPR-Cas9 介导的精准微生物基因组编辑,借助目标错配的 sgRNAPDF文件第3页

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