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Clelland 实验室协议 | iPSC 培养，第 1 页，共 5 页 iPSC 细胞...
培养基中，当细胞仍处于对数生长期时，将其转移到培养基中。一旦细胞接近 100% 汇合，它们就会进入平台期（静止期），其中只有不到 10% 的细胞在活跃分裂，并且细胞更容易受到压力的影响。这种低分裂率使得细胞系难以维持，并且增加了细胞系中随着时间的推移积累不想要的突变的可能性。2. 用基质胶溶液包被六孔板，并在 37°C 下孵育至少 30 分钟。
CRISPRi 基因调控和分化后人类 iPSC 心肌细胞的全光学电生理学
通过在人类诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞 (iPSC-CM) 中进行精确的基因调节并使用可扩展的全光学电生理学平台进行后续表型分析，可以揭示基因-表型关系。近期 CRISPR 衍生的可逆基因抑制或激活技术 (CRISPRi/a) 可以为人类功能基因组学方面的此类努力提供帮助。我们着手表征 CRISPRi 在后分化 iPSC-CM 中的性能，以关键的心脏离子通道基因 KCNH2、KCNJ2 和 GJA1 为目标，并使用全光学工具提供对心脏复极、静息膜电位稳定性和传导特性影响的多参数量化。更有效的 CRISPRi 效应物（例如 Zim3）和优化的病毒递送可使性能得到改善，与使用 CRISPRi iPSC 系相当。当 CRISPRi 部署在非分裂分化心脏细胞中时，确认轻微但具体的表型变化是朝着更全面的临床前心脏毒性测试和未来体内治疗应用迈出的重要一步。关键词：CRISPRi、iPSC-CM、心脏电生理学、离子通道、KCNH2、KCNJ2、GJA1、全光电生理学、光遗传学、光学映射
胶原蛋白 X 对于人类 iPSC 衍生软骨细胞的肥大性分化和软骨内骨化而言并非必不可少
摘要 X 型胶原蛋白是一种由肥大性软骨细胞产生的非纤维胶原蛋白，被认为与生长板软骨的钙化过程有关。然而，小鼠中 Col10a1 基因的纯合缺失对生长板形成或骨骼发育无显著影响。为了研究 X 型胶原蛋白在人类软骨细胞中的作用，我们使用双 sgRNA CRISPR/Cas9 系统建立了具有杂合（COL10A1 + / ）或纯合（COL10A1 / ）COL10A1 基因缺失的人类诱导多能干细胞 (hiPSC)。建立了几个突变克隆，并通过先前报道的 3D 诱导方法将其分化为肥大性软骨细胞。亲本与突变细胞系在分化过程中无明显差异，均分化为具有肥大性软骨细胞特征的细胞，提示X胶原蛋白对于人软骨细胞体外肥大性分化而言并非必不可少。为探究X胶原蛋白缺乏对体内的影响，将增殖期或肥大前期的软骨细胞颗粒移植到免疫缺陷小鼠体内。增殖期颗粒衍生组织显示软骨细胞呈带状分布，并转变为模拟生长板的骨组织，且骨的比例在 COL10A1 / 组织中趋于较大。肥大前期颗粒衍生组织产生具有软骨内骨化特征的骨小梁结构，亲本与突变体衍生组织之间无明显差异。对处于肥大期的软骨细胞颗粒进行转录组分析显示，与亲本细胞颗粒相比，COL10A1 / 颗粒中增殖期基因表达较低，钙化期基因表达较高。这些体外和体内数据表明，胶原蛋白 X 对于人类 iPSC 衍生软骨细胞的肥大分化和软骨内骨化是可有可无的，尽管它可能促进分化过程。因此，COL10A1 / iPSC 系可用于研究胶原蛋白 X 在软骨细胞分化中的生理作用。© 2023 作者。JBMR Plus 由 Wiley Periodicals LLC 代表美国骨矿研究学会出版。
通过转录因子过表达将人IPSC分化为功能性卵巢颗粒样细胞
摘要人类卵巢卵泡的体外模型将极大地有益于女性繁殖的研究。卵巢发育需要生殖细胞和几种类型的体细胞的结合。其中，颗粒细胞在卵泡形成和对卵子发生的支持中起关键作用。存在有效的方案来产生人类诱导的多能干细胞（HIPSC）的人类原始生殖细胞样细胞（HPGCLC），但产生颗粒细胞的一种方法是难以捉摸的。在这里，我们报告说，两个转录因子（TFS）的同时过表达可以将hipsc的分化指向颗粒样细胞。我们阐明了几种与颗粒相关的TF的调节作用，并确定NR5A1的过表达和Runx1或Runx2足以生成类似颗粒状的细胞。我们的颗粒状细胞具有类似于人类胎儿卵巢细胞的跨文章组，并概括了包括卵泡形成和类固醇生成在内的关键卵巢表型。与HPGCLC聚集时，我们的细胞形成卵巢样类器官（卵形），并支持从迁移到性腺阶段的HPGCLC发育，这是通过诱导DAZL表达来衡量的。该模型系统将为研究人类卵巢生物学提供独特的机会，并可以开发女性再生健康的疗法。
高效 CRISPR/Cas9 介导全色盲患者来源的 iPSC 中纯合突变的校正
摘要：全色盲是一种常染色体隐性遗传病，患者视锥细胞会逐渐退化，导致色盲和视力下降，以及其他严重的眼部病变。它属于一类遗传性视网膜营养不良症，目前尚无治疗方法。尽管一些正在进行的基因治疗研究报告了功能改善，但仍应开展更多努力和研究以增强其临床应用。近年来，基因组编辑已成为个性化医疗最有前途的工具之一。在本研究中，我们旨在通过 CRISPR/Cas9 和 TALENs 技术纠正全色盲患者 hiPSC 中的纯合 PDE6C 致病变异。在这里，我们展示了 CRISPR/Cas9 的高基因编辑效率，但 TALENs 近似值不高。尽管少数经过编辑的克隆表现出杂合的靶向缺陷，但具有潜在恢复的野生型 PDE6C 蛋白的校正克隆的比例占所分析克隆总数的一半以上。此外，它们中没有一个出现脱靶畸变。这些结果对单核苷酸基因编辑的进展和未来治疗全色盲的策略的发展做出了重大贡献。
反义寡核苷酸调节与SCN1A相关的Dravet综合征中毒药外显子的异常包含
摘要：随着发现诱导的多能干细胞（IPSC），现在可以从无限的体细胞来源产生多种细胞类型，包括IPSC衍生的心肌细胞（IPSC-CM）。这些IPSC-CM用于不同目的，例如疾病建模，药物发现，心脏毒性测试和个性化医学。2D IPSC-CM模型已显示出令人鼓舞的结果，但与体内成人心肌细胞相比，它们更不成熟。新颖的方法创建3D模型，并可能正在开发其他（心脏）细胞类型。这不仅会改善细胞的成熟度，而且还会导致更与人心脏更相似的生理相关模型。在这篇综述中，我们着重于2D和3D中遗传性心律不齐的建模以及这些模型在治疗开发和药物测试中的使用。
放大光化学的放大光化学
摘要：已经开发了基于诱导多能干细胞（IPSC）衍生的运动神经元（MN）的大量体外模型，以研究运动神经元疾病（MNDS）选择性MN变性的潜在原因。例如，球体是简单的3D模型，具有大量生成的潜力，可以在不同的测定中使用。在这项研究中，我们生成了MN球体，并开发了一种工作流以分析它们。开始，通过开发管道来获得其大小和形状的测量，可以实现球体的形态学填充。接下来，我们分别通过QPCR和组织清除样品的免疫细胞化学来确认不同Mn标记在转录本和蛋白质水平上的表达。最后，我们评估了Mn球体使用微电极阵列方法以动作电位和突发形式显示功能活动的能力。尽管大多数细胞都表现出MN身份，但我们还表征了其他细胞类型的存在，即中间神经元和少突胶质细胞，它们与MN共享相同的神经祖细胞池。总而言之，我们成功地开发了一种MN 3D模型，并优化了可以应用其形态学，基因表达，蛋白质和功能性培养的工作流，随着时间的流逝。
长 QT 综合征的精准医疗：患者特异性 iPSC 占据主导地位
长 QT 综合征 (LQTS) 是一种有害的心律失常综合征，主要由离子通道的表达失调或功能异常引起。室性心律失常、心悸和晕厥的主要临床症状因 LQTS 亚型而异。恶性心律失常的易感性是心肌细胞动作电位 (AP) 复极延迟的结果。LQTS 有 17 种不同的亚型，与 15 种具有单基因突变的常染色体显性基因有关。然而，由于修饰基因的存在，相同的突变可能导致不同携带者的临床表现完全不同。在这篇综述中，我们描述了各种离子通道在协调 AP 中的作用，并讨论了各种类型 LQTS 的分子病因。我们重点介绍了使用患者特定的诱导多能干细胞 (iPSC) 模型来表征与 LQTS 相关的基本机制。为了减轻 LQTS 的后果，治疗策略最初侧重于针对离子通道活性的小分子。下一代治疗将从 LQTS 患者特异性 iPSC 平台的开发中获益，该平台由全基因组测序、CRISPR 基因组编辑和机器学习等最先进的技术提供支持。使用 LQTS 患者特异性心肌细胞进行深度表型分析和高通量药物测试预示着 LQTS 精准医疗的到来。
基于 iPSC 技术生成首个人类麦卡德尔病体外模型
1 马德里 12 de Octubre 健康研究中心 (imas12) iPS 细胞转化研究组，28041 马德里，西班牙 2 马德里自治大学医学院生物化学系，“Alberto Sols”生物医学研究所 (UAM-CSIC)，28029 马德里，西班牙 3 马德里 12 de Octubre 健康研究中心 (imas12) 遗传学服务中心，28041 马德里，西班牙 4 马德里 12 de Octubre 健康研究中心 (imas12) 线粒体和神经肌肉疾病实验室，28041 马德里，西班牙 5 生物医学研究中心罕见疾病网络 (CIBERER) 提示，28029 马德里，西班牙 6 艾克斯-马赛大学，INSERM，MMG，13385 马赛，法国 7 分子、细胞和基因组生物医学研究组，健康研究所 La Fe (IIS La Fe)，46029 瓦伦西亚，西班牙 * 通讯地址：egallardo.imas12@h12o.es
MSCs 与 iPSC：治疗应用潜力
在过去的 20 年里，间充质干细胞 (MSC) 作为一种治疗多种疾病的独特方法引起了广泛关注。MSC 具有自我更新和多谱系分化能力、免疫调节和抗炎特性，使其能够在再生医学中发挥作用。此外，MSC 的致瘤性低且具有免疫特权，这使得同种异体 MSC 可用于治疗，而无需直接从患者身上采集 MSC。诱导性多能干细胞 (iPSC) 可以通过基因重编程从成体细胞中生成，并异位表达特定的多能因子。iPS 技术的进步避免了破坏胚胎来制造多能细胞，使其免于伦理问题。iPSC 可以自我更新并发展成大量特化细胞，使其成为再生医学的有用资源，因为它们可以从任何人类来源产生。 MSC 还被用于治疗感染 SARS-CoV-2 病毒的个体。由于 MSC 具有高致瘤性（可引发致癌转化），因此其临床试验比 iPSC 多。在这篇综述中，我们讨论了间充质干细胞和诱导性多能干细胞的概况。我们简要介绍了使用 MSC 和 iPSC 的治疗方法和 COVID-19 相关疾病。