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在哺乳动物干细胞中利用通用供体进行高效、快速的荧光蛋白敲入
摘要 荧光蛋白 (FP) 标记是细胞生物学的基础方法，因为它可以观察活细胞中的蛋白质分布、动态和与其他蛋白质的相互作用。然而，使用标记蛋白过表达的典型方法可能会扰乱细胞行为并引入定位伪影。为了保持天然表达，可以将荧光蛋白直接插入内源基因中。这种方法在酵母中已经是标准做法几十年了，最近随着 CRISPR/Cas9 的出现，在无脊椎动物模型生物中也成为标准做法。然而，由于同源定向修复 (HDR) 效率低下，内源荧光蛋白标记尚未在哺乳动物细胞中广泛使用。在这里，我们描述了一种简化的方法，用于通过小鼠胚胎干细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 将 FP 标签高效快速地整合到天然基因座中。我们的方案最大限度地减少了使用通用供体的克隆，允许对内源蛋白进行 N 端或 C 端标记，并且从转染到成像只需不到 2 周的时间，从而提高了 FP 敲入在哺乳动物细胞中的适用性。简介荧光蛋白（FP）敲入能够实现内源性标记，从而实现蛋白质可视化，而不会产生过表达伪影1。敲入策略可以让研究人员准确观察和测量活细胞中蛋白质表达、定位和相互作用的动态。自20世纪90年代以来，FP敲入一直是酵母中的标准做法，因为这种生物可以通过同源重组有效地整合FP供体2,3。最近，由于CRISPR/Cas9技术的出现10，FP敲入已在秀丽隐杆线虫4-7和果蝇8,9中得到广泛采用。当由单向导RNA（sgRNA）编程时，Cas9会引入靶向的DNA双链断裂（DSB），细胞可以通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）11进行修复。HDR因其高保真度而受到青睐12-15。然而，HDR 仅在某些细胞周期阶段 16 活跃，并且需要与靶标匹配的同源臂。因此，基于 HDR 的标记效率要低得多 17,18，并且需要在哺乳动物细胞中费力地克隆。为了规避这些限制，最近已引入 NHEJ 来在哺乳动物细胞中进行 FP 敲入 18–26 。一种名为 CRISPR 辅助插入标记 (CRISPaint) 22 的方法特别精简，因为它使用通用供体质粒，因此唯一需要的克隆是构建基因特异性 sgRNA。供体质粒通过转染引入细胞，与靶基因并行被 Cas9 切割，并通过 NHEJ 以非序列特异性的方式整合到靶基因中。为了允许使用任何基因特异性 sgRNA 同时保持正确的阅读框架，CRISPaint 使用通用的“框架选择器”在三种可能的阅读框架之一中切割通用供体 22 。尽管有这些优势，到目前为止，CRISPaint 仅在少数细胞系中进行了测试。此外，目前形式的 CRISPaint 系统仅可进行 C 端插入，这限制了其应用于蛋白质产物可耐受 C 端标记的基因。在这里，我们描述了一种基于 CRISPaint 的改进方法，该方法可在哺乳动物细胞中灵活、快速地在基因的任一端进行 FP 标记。我们的方法高效，需要的克隆最少，并且可以产生在天然调控元件的控制下表达的功能性内源性标记蛋白。我们在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中测试并优化了这种方法。我们在第一次尝试中成功标记了 5/5 个目标，从转染到成像的时间只有 2 周。此外，我们还构建了一组用于多色标记的质粒。总之，这些进展将促进 mESC 和其他哺乳动物细胞中的细胞生物学研究，并可能提供更快、更简单的快速创建敲入小鼠的途径。
哺乳动物雷帕霉素靶向抑制剂在肠道和多脏器移植后的疗效和安全性
1. Matsumoto CS, Subramanian S, Fishbein TM。成人肠道移植。北美胃肠病学杂志。2018；47(2):341-354。2. Lacaille F。1987 年首例肠道移植 30 年后：2018 年还有哪些适应症？器官移植最新观点。2018；23(2):196-198。3. Bharadwaj S、Tandon P、Gohel TD 等。肠道和多内脏移植的现状。胃肠病学杂志。2017；5(1):20-28。4. Herlenius G、Fagerlind M、Krantz M 等。慢性肾病——肠道移植后常见且严重的并发症。移植。 2008;86(1):108-113。5. Huard G、Iyer K、Moon J、Doucette JT、Nair V、Schiano TD。小肠移植后严重慢性肾病的高发病率及其对患者和移植物存活率的影响。临床移植。2017；31(5)：e12942。6. Morelon E、Kreis H。不使用钙调磷酸酶抑制剂的雷帕霉素疗法：Necker 医院 8 年经验。移植程序。2003；35(3 Suppl)：52s-57s。7. Schena FP、Pascoe MD、Alberu J 等。从钙调磷酸酶
氧化应激与生殖功能 保护哺乳动物精子免受氧化应激
·– ）的产生受 SOD2 控制，而 SOD2 活性产生的过氧化氢（H 2 O 2 ）和过氧亚硝酸盐（ONOO – ）主要由人类精子中的 PRDX 清除。PRDX 调节精子运动和获能所必需的氧化还原信号，尤其是通过 PRDX6。这种酶是抵御氧化应激的第一道防线，通过其过氧化物酶活性清除 H 2 O 2 和 ONOO – 并通过其钙独立的磷脂酶 A 2 活性修复氧化膜，从而防止脂质过氧化和 DNA 氧化。抗氧化疗法在治疗不孕症方面的成功取决于正确诊断是否存在氧化应激以及产生了哪种类型的 ROS。因此，更多关于氧化应激影响的分子机制的研究、开发新的诊断工具来识别患有氧化应激的不育患者以及随机对照试验对于制定个性化的抗氧化疗法以恢复男性生育能力至关重要。复制 (2022) 164 F67–F78
小鼠 γ-突触核蛋白启动子介导的哺乳动物视网膜神经节细胞中的基因表达和编辑
4 王启照 1,3 , 庄培 1,3 , 黄浩亮 1 , 李亮 1 , 刘亮 1 , Hannah C. Webber 1 , 5 Roopa Dalal 1 , Leonard Siew 1 , Clarisse M. Fligor 2 , Kun-Che Chang 1 , Michael Nahmou 1 , Alexander 6 Kreymerman 1 , Yang Sun 1 , Jason S. Meyer 2 , Jeffrey Louis Goldberg 1 和杨虎 1,* 7 8
映射在指数增殖的哺乳动物细胞中单拷贝基因座的DNA复制的起源
最近已经开发了一种用于确定双向DNA复制起源的物理位置的一般方法，并证明能够正确识别Simian病毒40复制的起源（L. vassilev和E. M. Johnson，Nucleic Acids，Res。17：7693-7705，1989）。该方法比以前报道的其他方法的优点是，它避免了使用代谢抑制剂的使用，细胞同步的需求以及对原点序列的多个副本的需求。将这种方法应用于含有未扩增的单拷贝二氢叶酸还原酶基因基因座的非扩增，单拷贝的卵巢凝胶的应用显示，DNA的复制在大约2.5千千公斤的起始区域开始，大约2.5个千千万酶，长期以来，长期以来，长期以来，大约17千千千万的基础与DHFR Gene的下降序列相结合，以前是早期复制的。这些结果证明了该映射方案用于识别复制的celular起源的实用性，并建议在正常和放大的DHFR基因座中使用相同的cedlular起源。
景观水平的人类干扰导致热带森林中哺乳动物种群的丧失和收缩
Ilaria Greco ID 1 *，Lyelic Beaudrot 2.3，Chris Sutherland 4，Simone Tenan 5，Syone 2.3，Daniel Gorzynski 6，Ahumada 13，Rajan Amin 14，Megan Baker-Watton 1 Cremonesi 1 Cremonesi 1 Cremonesi 1 Cremonesi 1 Cremonesi 23：Adeline Fayolle 22:28，Adeline Fayolle 22:28，Davy Fonty Harry 31 22 Alys Granados 32.33，Patrick A. Jansen 34.35，Jayasilan Mohd-Azlan 11，Caspian Johnson Marcelo Magio 21：41,42，Emanuel H. Martin 43，Adriano Martinole版本28，Patrics C. Wright C. Wright C. Wright 25.50，C.
哺乳动物细胞中小分子诱导基因调控系统的研究进展及设计原理
小分子诱导基因回路是生物学中最重要的工具之一，因为它们提供了一种方便的方式来精确调节生物系统。这些系统通常旨在在多个层面上控制基因激活、抑制或破坏，例如通过基因组修饰、转录、翻译或蛋白质活性的翻译后调节。由于它们的重要性，过去几年已经创建了许多新系统来满足不同的需求或提供正交性。它们可以根据所使用的诱导剂、调节模式和实现调节的效应蛋白进行广泛的表征。此外，每个合成电路都有不同的性能指标和设计考虑因素。在这里，我们对最近开发的工具进行了简要比较，并推荐了标准化指标来评估它们作为生物检测剂或治疗剂的性能和潜力。
jULIEs：用于哺乳动物大脑低创伤性细胞外记录和刺激的纳米结构多极电极
1 英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所感觉回路和神经技术实验室 2 英国伦敦大学学院神经科学、生理学和药理学系 3 德国海德堡马克斯·普朗克医学研究所行为神经生理学 4 德国海德堡大学医学院解剖学和细胞生物学系 5 英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所皮质回路实验室 6 德国哥廷根马克斯·普朗克实验医学研究所神经遗传学系 7 德国柏林夏洛特医学院神经科学研究中心感觉门控和皮质下-皮质相互作用 8 英国南安普顿大学电子与计算机科学学院电子前沿中心 9 英国伦敦帝国理工学院生物工程系 10 美国华盛顿大学生物结构系WA，美国 11 皮质回路，地中海神经生物学研究所，艾克斯-马赛大学，法国马赛 12 现地址：英国伦敦帝国理工学院生物工程系。13 同等贡献 ∗ 任何通讯作者均应致函。
哺乳动物牛奶微生物：多样性，潜在功能和未来研究方向的来源
关于牛奶微生物组的生存能力和功能的出色问题。牛奶微生物可以来自母体胃肠道，口腔，皮肤和乳腺微生物组，以及新生儿口服和皮肤微生物组。鉴于微生物来源的种类，随机过程强烈影响牛奶微生物组的组装，但牛奶微生物组似乎受到母性进化史，饮食，环境和牛奶营养的影响。牛奶微生物来定植新生儿肠道，并产生影响生理，代谢和免疫系统发育的基因和代谢产物。有限的流行病学数据表明，早期对牛奶微生物的暴露会导致积极的长期健康结果。可以通过饮食变化来改变牛奶微生物，包括为母亲提供益生菌和益生元。牛奶替代品（即婴儿配方）可能会受益于补充益生菌和益生元，但缺乏益生菌的有用性数据，并且补充应基于证据。总体而言，在人类和模型系统之外的牛奶微生物组文献很少。我们强调了模型物种与跨哺乳动物比较研究的机械研究的必要性，以进一步了解我们对哺乳动物牛奶微生物组进化的理解。对牛奶微生物组的一项更广泛的研究有可能为动物护理提供与现场濒危物种相关的信息。
FEMA：大型样品全脑成像数据的快速有效的混合效应算法
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