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可编程的哺乳动物翻译调节剂通过CRISPR相关蛋白
摘要合成遗传回路的复杂性依赖于具有高正交性的生物电路的曲目。尽管依赖RNA结合蛋白（RBP）的转录后电路符合曲目的资格，但监管设备的有限库阻碍了网络网络模块化和可扩展性。在这里，我们建议将墨盒（CAS响应转化调节可集成到多样化的基因组工程中）以将CRISPR相关（CAS）蛋白作为转化调节剂重新利用。我们证明了一组CAS蛋白能够抑制（OFF）或激活（ON）5'-UTR中包含CAS结合RNA基序的mRNA翻译。我们设计了81种不同类型的翻译，并在开关上验证了它们的功能特征。其中许多功能充当有效的翻译调节剂，并在哺乳动物细胞中显示正交性。通过互连这些开关，我们设计和构建了人工电路，包括60个翻译和大门。此外，我们表明，可以重新使用各种与CRISPR相关的技术，包括抗Crispr和Split-Cas9平台，以控制翻译。我们的CAS介导的翻译调节与CAS蛋白的转录调节兼容，并增加了元素较少的合成回路的复杂性。弹药筒比以往任何时候都更加构建蛋白质响应的mRNA开关，并导致CAS介导的基因组编辑和翻译调节技术的发展。
哺乳动物基因组调节和编辑的工程小型CRISPR-CAS系统
紧凑型和多功能的CRISPR-CAS系统将在各种环境中通过高功能交付来实现基因组工程应用。在这里，我们创建了一种通过引导RNA和蛋白质工程设计从V型Cas12f（Cas14）系统设计的有效的微型CAS系统（Casmini），该系统的大小不到当前使用的CRISPR系统（CAS9或CAS12A）的一半。我们证明，Casmini可以驱动高水平的基因激活（最大增加），而天然CAS12F系统无法在哺乳动物细胞中起作用。我们表明，Casmini系统具有与CAS12A相当的基因激活活动，具有高度特定的，并且允许稳健的基础编辑和基因编辑。我们期望Casmini对细胞工程和基因治疗应用具有广泛的用处，并在体内和体内有用。
在哺乳动物细胞中的敲入和敲除CRISPR/CAS9编辑作者：Michael Hanna 1，Pietro de Camilli 1 1 Neurosc的部门
在哺乳动物细胞中的敲击和淘汰CRISPR/CAS9编辑作者：Michael Hanna 1，Pietro de Camilli 1 1 1 1神经科学和细胞生物学部门，霍华德·休斯医学研究所，霍华德·休斯医学研究所，在纽约州纽约市纽黑文，纽约州纽黑文的蜂窝神经科学，神经变性和维修，纽约州纽黑文，纽约市210年6月210日，纽约市，纽约州。雪佛兰·蔡斯（Chevy Chase），医学博士，20815摘要该方案是为了帮助使用与上述出版物DPI相关的CRISPR/CAS9产生基因组和基因组编辑的哺乳动物细胞系（手稿尚未提交）。所需的缓冲液排序缓冲液1X DPB 0.02％EDTA 0.2％FBS敲除哺乳动物细胞系
靶向选择素，siglecs和哺乳动物聚糖
聚糖参与细胞和有机生物学的基本方面，例如受体介导的细胞与正常过程和病原过程的基础的细胞相互作用。的确，细胞表面上的聚糖的致密层（糖蛋白）可以从某些细胞上的质膜延伸超过30 nm。细胞表面蛋白因此被嵌入在聚糖基质中。聚糖的各种功能与它们的各种结构相匹配。Glycans can be conjugated to proteins (to form glycoproteins , proteoglycans and glycosylphos- phatidylinositol (GPI)-anchored proteins) and lipids (to form glycolipids), or they can be secreted without conju- gation to other macromolecules (in the form of glycos- aminoglycans such作为透明质酸）。In humans, glycans are primarily constructed from ten monosaccharides: glucose (Glc), galactose (Gal), N -acetylglucosamine (GlcNAc), N -acetylgalactosamine (GalNAc), fucose (Fuc), xylose (Xyl), sialic acid (Neu5Ac), glucuronic acid (GlcA), mannose (Man) and id酸酸（IDOA）。通过与内质网和高尔基体相关的酶，将这些单糖的组装到聚糖中。单糖通过一种糖的异构碳和另一种羟基的糖苷碳连接在一起。糖苷键相对于异体碳（α与β）的方向影响聚糖的整体形状。因此，例如，乳糖galβ1-4Glc的符号是指通过葡萄糖C4上的β-糖苷键与羟基的半乳糖相关的。仅考虑这些因素，就有
通过介电油中的水滴进行电滴来将基因递送到哺乳动物细胞中的机理研究div>
，我们基于通过介电油中的水滴进行了短路，开发了一种新的方法，用于传递可渗透细胞的分子。将细胞悬架液滴放在具有强烈直流电场的一对电极之间，液滴弹跳和液滴变形，这会导致瞬时短路，这取决于电场强度。我们已经证明了使用短路成功地转移了各种哺乳动物细胞。但是，分子机械主义仍有待阐明。在这项研究中，用Jurkat细胞进行流式细胞仪测定。用液滴弹跳或短路处理含有jurkat细胞的水滴和带有荧光蛋白的质粒。短路可导致24小时孵育后足够的细胞活力和荧光蛋白表达。在很重要的情况下，液滴弹跳并未导致成功转染基因转染。通过摄取可耐细胞荧光染料yo-pro-1和钙离子的涌入来研究瞬态膜孔的形成。结果，短路增加了Yo-Pro-1氟-1荧光强度和细胞内钙离子浓度，但液滴弹跳没有。我们还研究了内吞作用对转染的贡献。用内吞作用抑制剂对细胞的预处理以依赖性的方式降低了基因转染的效率。此外，使用pH敏感的染料偶联物表明在短路后内体中形成了酸性环境。内吞作用是细胞内递送外源性DNA的可能机制。
哺乳动物细胞中的耦合基因编辑
通过转染短单链寡脱氧核糖核苷酸（SSODN），可以将小基因组改变引入高精度的哺乳动物细胞中。ssodns在DNA复制过程中集成到基因组中，但是由DNA不匹配修复（MMR）易于检测所得的杂化，从而阻止了有效的基因修饰。我们以前已经证明，当Ssodn中的核苷酸不匹配是锁定的核酸（LNA）时，可以避免MMR的抑制作用。在这里，我们揭示了LNA修饰的SSODN（LMOS）并未作为哺乳动物细胞中的完整实体整合，而是在靶杂交之前和之后被严重截断。我们发现，LMO的5'-arm臂中的单个额外（非LNA修饰）突变影响靶向效率，并激活了MMR途径。相比之下，3'-ARM中的其他突变不会影响靶向效率，并且不受MMR的影响。甚至更引人注目的是，3'-arr中的同源性在很大程度上是有效靶向的，暗示了大量的3'末端修剪。我们提出了一个在包括LMO降解的哺乳动物细胞中LMO指导基因修饰的精制模型。
非哺乳动物模型生物的心脏发展和再生
心血管疾病是对人类健康的严重威胁，是全球死亡率的主要原因。近年来，在理解心脏形成和发育方面取得了令人兴奋的进步，使心脏生物学家能够在治疗性心脏再生领域取得显着进步。我们对心脏发育和再生的大部分理解，包括基因和信号途径，都是由非哺乳动物模型生物（例如水果质量，鱼类，青蛙和鸡肉）的开拓性作品驱动的。与哺乳动物模型相比，非哺乳动物模型生物在高通量应用中具有特殊优势，例如疾病建模，药物发现和心脏毒性筛查。心血管疾病的基因工程动物提供了研究发病机理的分子和细胞机制并评估治疗策略的有价值的工具。已经建立了大量的先天性心脏病（CHD）非哺乳动物模型，并测试了涉及疾病的基因和信号通路。在这里，我们回顾了这些模型所揭示的心脏发展和再生的机制，突出了非哺乳动物模型作为心脏研究工具的优势。这些动物模型的知识将促进治疗发现，并最终加速转化医学。
大脑的广场荧光来源
抽象神经元通过包装到突触囊泡（SVS）中的小分子神经递质的活动依赖性释放来传达。尽管许多分子已被鉴定为神经递质，但技术局限性排除了对SV含量的完整代谢组学分析。在这里，我们提出了一个快速分离SV的工作流程，并使用质谱法以高分辨率询问其代谢含量。我们使用靶向极性代谢组学验证了原代皮质神经元中谷氨酸的富集。从这些神经元中分离出的SV的无偏和广泛的全球分析表明，它们唯一可以检测到的极性代谢物是已建立的神经递质谷氨酸和GABA。此外，我们采用了直接从脑组织中快速捕获SV的方法，并以细胞类型的特异性方式确定了不同脑区域的神经递质谱。询问SV内容的方法的速度，鲁棒性和精度将促进对神经传递的化学基础的新见解。
ap-1亚基在增强子处串联以增强转录
哺乳动物细胞中的遗传筛选通常专注于功能丧失方法。评估额外基因拷贝的表型结合，我们使用了辐射杂种（RH）细胞的大量分离分析（BSA）。，我们构建了六个RH细胞池，每个池由约2500个独立克隆组成，并将池放置在带有或没有紫杉醇的培养基中。低通序测序鉴定出859个生长基因座，38个紫杉醇基因座，62个相互作用基因座和三个基因座，用于整个基因组显着性，用于线粒体的丰度。分辨率被测量为约30 kb，接近单基因。差异性能，反驳了平衡假设。此外，在RH池中人类centromeres的保留增强提出了一种对这些染色体元件的功能解剖方法的新方法。对RH细胞的合并分析显示出高功率和分辨率，应该是哺乳动物遗传工具包的有用补充。
哺乳动物精子的MTT减少模式
mtt在生物学中被广泛用作细胞活力的探针，因为它能够在强烈的氧化还原酶活性部位产生不溶性甲贡祖的沉积物。这种反应通常以反映线粒体氧化还原活性；但是，在某些细胞类型中也记录了线粒体MTT减少。鉴于这种背景，我们着手确定哺乳动物精子中甲唑沉积的主要地点。在小鼠中，大多数MTT还原发生在广泛的线粒体回旋中，精子头上有一个次要的formazan沉积部位。相比之下，人类精子通常显示出小小的混乱的中件，表现出适度的MTT减少活动，并在精子头的各个位置从脖子到前杂质体的精子头部的各个位置伴随着主要的金属软骨外甲氮杂沉积物。马精子呈现了这两种模式的组合，在线粒体中的主要formazan沉积伴随着大约20％的细胞中的线粒体外甲米唑沉积物。人类精子的功能与一种甲米甲酸甲珠外颗粒的存在正相关。随后的研究表明，存在二苯基碘，锌，2-脱氧葡萄糖，共酶Q，一种模拟和NADPH氧化酶抑制剂的二苯基碘，锌，2-脱氧葡萄糖，锌，锌，2-脱氧葡萄糖，抑制这种线粒体的活性。我们得出的结论是，精子的MTT将MTT降低为特定于物种，并传达了有关线粒体与线粒体外氧化还原活性的相对重要性的重要信息，从而定义了这些细胞的功能质量。繁殖（2020）160 431–443