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氧化应激与生殖功能 保护哺乳动物精子免受氧化应激
·– ）的产生受 SOD2 控制，而 SOD2 活性产生的过氧化氢（H 2 O 2 ）和过氧亚硝酸盐（ONOO – ）主要由人类精子中的 PRDX 清除。PRDX 调节精子运动和获能所必需的氧化还原信号，尤其是通过 PRDX6。这种酶是抵御氧化应激的第一道防线，通过其过氧化物酶活性清除 H 2 O 2 和 ONOO – 并通过其钙独立的磷脂酶 A 2 活性修复氧化膜，从而防止脂质过氧化和 DNA 氧化。抗氧化疗法在治疗不孕症方面的成功取决于正确诊断是否存在氧化应激以及产生了哪种类型的 ROS。因此，更多关于氧化应激影响的分子机制的研究、开发新的诊断工具来识别患有氧化应激的不育患者以及随机对照试验对于制定个性化的抗氧化疗法以恢复男性生育能力至关重要。复制 (2022) 164 F67–F78
在哺乳动物干细胞中利用通用供体进行高效、快速的荧光蛋白敲入
摘要 荧光蛋白 (FP) 标记是细胞生物学的基础方法，因为它可以观察活细胞中的蛋白质分布、动态和与其他蛋白质的相互作用。然而，使用标记蛋白过表达的典型方法可能会扰乱细胞行为并引入定位伪影。为了保持天然表达，可以将荧光蛋白直接插入内源基因中。这种方法在酵母中已经是标准做法几十年了，最近随着 CRISPR/Cas9 的出现，在无脊椎动物模型生物中也成为标准做法。然而，由于同源定向修复 (HDR) 效率低下，内源荧光蛋白标记尚未在哺乳动物细胞中广泛使用。在这里，我们描述了一种简化的方法，用于通过小鼠胚胎干细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 将 FP 标签高效快速地整合到天然基因座中。我们的方案最大限度地减少了使用通用供体的克隆，允许对内源蛋白进行 N 端或 C 端标记，并且从转染到成像只需不到 2 周的时间，从而提高了 FP 敲入在哺乳动物细胞中的适用性。简介荧光蛋白（FP）敲入能够实现内源性标记，从而实现蛋白质可视化，而不会产生过表达伪影1。敲入策略可以让研究人员准确观察和测量活细胞中蛋白质表达、定位和相互作用的动态。自20世纪90年代以来，FP敲入一直是酵母中的标准做法，因为这种生物可以通过同源重组有效地整合FP供体2,3。最近，由于CRISPR/Cas9技术的出现10，FP敲入已在秀丽隐杆线虫4-7和果蝇8,9中得到广泛采用。当由单向导RNA（sgRNA）编程时，Cas9会引入靶向的DNA双链断裂（DSB），细胞可以通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）11进行修复。HDR因其高保真度而受到青睐12-15。然而，HDR 仅在某些细胞周期阶段 16 活跃，并且需要与靶标匹配的同源臂。因此，基于 HDR 的标记效率要低得多 17,18，并且需要在哺乳动物细胞中费力地克隆。为了规避这些限制，最近已引入 NHEJ 来在哺乳动物细胞中进行 FP 敲入 18–26 。一种名为 CRISPR 辅助插入标记 (CRISPaint) 22 的方法特别精简，因为它使用通用供体质粒，因此唯一需要的克隆是构建基因特异性 sgRNA。供体质粒通过转染引入细胞，与靶基因并行被 Cas9 切割，并通过 NHEJ 以非序列特异性的方式整合到靶基因中。为了允许使用任何基因特异性 sgRNA 同时保持正确的阅读框架，CRISPaint 使用通用的“框架选择器”在三种可能的阅读框架之一中切割通用供体 22 。尽管有这些优势，到目前为止，CRISPaint 仅在少数细胞系中进行了测试。此外，目前形式的 CRISPaint 系统仅可进行 C 端插入，这限制了其应用于蛋白质产物可耐受 C 端标记的基因。在这里，我们描述了一种基于 CRISPaint 的改进方法，该方法可在哺乳动物细胞中灵活、快速地在基因的任一端进行 FP 标记。我们的方法高效，需要的克隆最少，并且可以产生在天然调控元件的控制下表达的功能性内源性标记蛋白。我们在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中测试并优化了这种方法。我们在第一次尝试中成功标记了 5/5 个目标，从转染到成像的时间只有 2 周。此外，我们还构建了一组用于多色标记的质粒。总之，这些进展将促进 mESC 和其他哺乳动物细胞中的细胞生物学研究，并可能提供更快、更简单的快速创建敲入小鼠的途径。
硫化氢在哺乳动物细胞，组织和器官中的生理作用
H 2 S现在被认为是多种哺乳动物细胞和组织中的内源性生理调节剂。Produced, in a regulated and cell type-dependent manner, by three major enzyme systems, cystathionine c -lyase (CSE), cystathio- nine b -synthase (CBS), and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3-MST), H 2 S is present intra- and extracellularly and interacts with proteins, DNA, and other members of the reactive species interactome （例如，氧和氮衍生的氧化剂和自由基）并在各种目标和途径上发挥作用。H 2 S的生理作用在基因转录和翻译，细胞生物能学和代谢，血管张力和免疫功能中的调节中得到充分认识，在中枢神经系统和周围神经系统的各种功能以及与生理学家和临床医生相关的许多其他领域的调节中。本综述对H 2 S在哺乳动物细胞和器官中的生理调节作用进行了全面概述。在生理状况下对这些作用的理解以及对H 2 S稳态的扰动的日益了解（例如，血管疾病，血管疾病，代谢性疾病，各种形式的中枢神经系统疾病，各种形式的中枢神经系统疾病，对跨性别疾病的疾病，其他机构的疾病以及其他机理疗法的诊断和诊断的新机会。在这种情况下，基于H 2 s的替换（通过H 2 s-释放的小分子）的新型实验治疗方法已经出现，并正在转化为临床竞技场。在本综述中突出显示，由于生物合成和/或降解增加，在某些疾病中，H 2 S水平在病理上降低了（例如，再灌注损伤，动脉粥样硬化，动脉粥样硬化以及许多其他形式的血管疾病，以及衰减）。在其他疾病（例如，各种形式的炎症，唐氏综合症和癌症）中，H 2 S水平增加，并且抑制H 2 S产生酶正在作为一种实验性治疗方法出现。进一步了解H 2 S的生理调节作用，再加上旨在调节H 2 S稳态的小分子的药理学和翻译科学的进步，预计将来会产生新颖的诊断和临床疗法方法。
基于活动的哺乳动物细胞膜编辑器的定向进化
细胞膜含有多种脂质，由于缺乏原位控制调节膜组成的方法，人们对于单个脂质生物学功能的了解一直受到阻碍。在这里，我们提出了一种编辑磷脂的策略，磷脂是生物膜中最丰富的脂质。我们的膜编辑器基于细菌磷脂酶 D (PLD)，它通过水或外源醇对磷脂酰胆碱进行水解或转磷脂酰化来交换磷脂头部基团。利用哺乳动物细胞中活性依赖性的定向酶进化，我们开发并从结构上表征了一个“超级PLD”家族，其活性比野生型 PLD 高 100 倍。我们证明了超级PLD 在活细胞中特定细胞器膜内光遗传学编辑磷脂以及体外生物催化合成天然和非天然设计磷脂的实用性。除了超级PLD之外，哺乳动物细胞中基于活动的定向酶进化是一种可推广的方法，可以设计出额外的化学酶生物分子编辑器。
SuperFi-Cas9表现出极高的保真度，但哺乳动物细胞的活性降低
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证未通过同行评审获得证明）是作者/资助者，他已授予Biorxiv授予Biorxiv的许可，以永久显示预印本。它是制作
量子硬件上的超跨性汉密尔顿特征状态的实时演变
摘要CRISPR/CAS9系统最初是从原核生物适应性免疫系统中得出的，已作为有效的基因组编辑工具开发。它可以通过可编程SGRNA与靶DNA的特定结合对染色体DNA进行精确的基因操纵，并且具有内切核酸酶活性的CAS9蛋白将在特定位点减少双链断裂。然而，CAS9是哺乳动物细胞中的一种异物，与引入哺乳动物细胞有关的潜在风险尚不完全了解。在这项研究中，我们对HEK293T细胞中的链球菌CAS9（Spycas9）进行了下拉和质谱分析（MS）分析，并表明大多数Cas9-相关蛋白质由MS鉴定的大多数相关蛋白在核中局部局部。有趣的是，我们进一步发现CAS9蛋白包含编码核仁拘留信号（NODS）的序列。与野生型（WT）Cas9相比，CAS9的点突变变体（MCAS9）较小
jULIEs：用于哺乳动物大脑低创伤性细胞外记录和刺激的纳米结构多极电极
1 英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所感觉回路和神经技术实验室 2 英国伦敦大学学院神经科学、生理学和药理学系 3 德国海德堡马克斯·普朗克医学研究所行为神经生理学 4 德国海德堡大学医学院解剖学和细胞生物学系 5 英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所皮质回路实验室 6 德国哥廷根马克斯·普朗克实验医学研究所神经遗传学系 7 德国柏林夏洛特医学院神经科学研究中心感觉门控和皮质下-皮质相互作用 8 英国南安普顿大学电子与计算机科学学院电子前沿中心 9 英国伦敦帝国理工学院生物工程系 10 美国华盛顿大学生物结构系WA，美国 11 皮质回路，地中海神经生物学研究所，艾克斯-马赛大学，法国马赛 12 现地址：英国伦敦帝国理工学院生物工程系。13 同等贡献 ∗ 任何通讯作者均应致函。
寻找并切割转移 (FiCAT) 哺乳动物基因组工程
虽然存在多种用于小等位基因基因组编辑的技术，但仍然缺乏用于在哺乳动物基因组中靶向整合大 DNA 片段的强大技术。在这里，我们开发了一种基因传递工具 (FiCAT)，它结合了 CRISPR-Cas9（发现模块）的精确度和工程化 piggyBac 转座酶（切割和转移模块）的有效载荷转移效率。FiCAT 结合了 Cas9 DNA 扫描和靶向 DNA 的功能以及 piggyBac 供体 DNA 处理和转移能力。PiggyBac 功能域经过工程设计，可提高靶向整合率，同时减少脱靶事件。我们展示了在细胞（人类（Hek293T、K-562）和小鼠（C2C12））和小鼠肝脏体内有效传递和可编程插入小型和大型有效载荷。最后，我们通过生成 394,000 个变体的靶向多样性并进行 4 轮进化，开发出更高效的 FiCAT 版本。在这项工作中，我们开发了一种在哺乳动物基因组中精确、有效地靶向插入多千碱基 DNA 片段的方法。
针对哺乳动物细胞进行优化的全基因组无病毒 CRISPR 筛选
Kai Xiong, 1 Karen Julie la Cour Karottki, 1 Hooman Hefzi, 2,5 Songyuan Li, 1 Lise Marie Grav, 1 Shangzhong Li, 2,6 Philipp Spahn, 2,5 Jae Seong Lee, 3 Ildze Ventina, 1 Gyun Min Lee, 1,4 Nathan E. Lewis, 2,5,6 Helene Faustrup Kildegaard, 1 和 Lasse Ebdrup Pedersen 1,7,8,* 1 丹麦技术大学诺和诺德基金会生物可持续性中心，丹麦灵比 2 加州大学圣地亚哥分校诺和诺德基金会生物可持续性中心，美国加利福尼亚州拉霍亚 3 亚洲大学分子科学与技术系，韩国水原 16499 4 韩国科学技术研究院生物科学系，大田 5加州大学圣地亚哥分校儿科，美国加利福尼亚州拉霍亚 6 加州大学圣地亚哥分校生物工程系，美国加利福尼亚州拉霍亚 7 丹麦技术大学生物工程系，丹麦林比 8 主要联系人 *通信地址：laeb@dtu.dk https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2021.100062
Y 染色体在哺乳动物精子发生中的作用
简介在兽亚纲哺乳动物中，除了一些例外，胚胎是否会发育为雄性或雌性取决于 Y 染色体的存在与否 (Capel, 2017)。雄性携带一个 X 染色体和一个 Y 染色体，而雌性携带两个 X 染色体。这是两性之间最根本的遗传差异，也是众多研究的主题。从历史上看，Y 染色体的生物学功能一直被误解。从 20 世纪 50 年代开始，它被认为是一片遗传荒地，因为对人类谱系的研究只发现了常染色体或 X 连锁遗传的特征 (Stern, 1957)。1959 年，研究表明男性决定基因是 Y 连锁的，但这被认为是一条功能惰性染色体上的例外 (Ford et al., 1959; Jacobs and Strong, 1959)。当转录单位首次在 Y 染色体上被发现时（Agulnik 等人，1994 年；Arnemann 等人，1991 年；Page 等人，1987 年；Reijo 等人，1995 年；Salido 等人，1992 年；Sinclair 等人，1990 年），人们认为它们是其前常染色体祖先的失活痕迹（Marshall Graves，1995 年）。最近，“濒死”理论假设 Y 蛋白编码基因不断丢失，预示着 Y 染色体最终会丢失（Aitken and Marshall Graves，2002 年；Marshall Graves，2004 年）。我们现在知道，将 Y 染色体视为正在消失的遗传沙漠的观点是错误的。数十年的研究证明，除了控制男性性腺的性别决定外，Y 染色体对于精子发生的初始化、维持和完成也至关重要。在这篇综述中，我们首先描述了 X-Y 染色体对的进化历史，然后将其作为范例来了解 Y 染色体如何在哺乳动物中变得功能特化。我们以人类和小鼠为重点，讨论了 Y 染色体不仅仅是性别转换的早期证据，以及随后发现与精子发生有关的 Y 基因的努力。然后，我们强调了实验限制如何影响该领域的进展，并提出了丰富我们对 Y 染色体功能理解的方法。