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针对哺乳动物细胞进行优化的全基因组无病毒 CRISPR 筛选
Kai Xiong, 1 Karen Julie la Cour Karottki, 1 Hooman Hefzi, 2,5 Songyuan Li, 1 Lise Marie Grav, 1 Shangzhong Li, 2,6 Philipp Spahn, 2,5 Jae Seong Lee, 3 Ildze Ventina, 1 Gyun Min Lee, 1,4 Nathan E. Lewis, 2,5,6 Helene Faustrup Kildegaard, 1 和 Lasse Ebdrup Pedersen 1,7,8,* 1 丹麦技术大学诺和诺德基金会生物可持续性中心，丹麦灵比 2 加州大学圣地亚哥分校诺和诺德基金会生物可持续性中心，美国加利福尼亚州拉霍亚 3 亚洲大学分子科学与技术系，韩国水原 16499 4 韩国科学技术研究院生物科学系，大田 5加州大学圣地亚哥分校儿科，美国加利福尼亚州拉霍亚 6 加州大学圣地亚哥分校生物工程系，美国加利福尼亚州拉霍亚 7 丹麦技术大学生物工程系，丹麦林比 8 主要联系人 *通信地址：laeb@dtu.dk https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2021.100062
工具用于定量分馏哺乳动物细胞的一般方法
引言真核核被核包膜（NE）包围，并以染色体形式包含大部分细胞的遗传物质（Clark等，2019; Webster等，2009）。它代表了几个膜 - 分隔的细胞器中最突出的，每个细胞器都有其自身和动态的组成（Cohen等，2018; Cole，2016; Schrader等，2015）。大分子的核质运输是在cy- toplasm和核之间发生的连续高度调节过程（Alberts等，2002; Christie等，2016; MacAra，2001; MacAra，2001; Silver，1991; Silver，1991; Wente and watee and Rout，2010; Yoneda; Yoneda》，1997年）。每种大分子的正确核细胞质定位是维持细胞稳态的关键（Bauer等，2015； Park等，2011）。分子进出核的转运是由嵌入在NE中的核孔复合物（NPC）所介绍的。单个NPC由约30种不同蛋白质的多个拷贝组成，称为核苷（Nups; Dultz等，2022; Stewart，2022; Tingey et al。，2022; Wing et al。，2022），并且不仅对核细胞的运输量不仅对核细胞的依恋; Al。，2022）。蛋白质的异常核细胞质定位已与许多人类疾病的发病机理有关，例如癌症，代谢，心血管和神经模型 - 生成性疾病（Chung等，2018; Holmes et al。有几种机制可能导致蛋白质错误定位，例如贩运机制的改变，蛋白质靶向信号的改变以及蛋白质的变化更具体地说，癌蛋白，抑制剂和其他与癌症相关的蛋白质的错误定位会干扰正常的细胞稳态，并导致肿瘤发育和转移（Wang and Li，2014）。
基于活动的哺乳动物细胞膜编辑器的定向进化
细胞膜含有多种脂质，由于缺乏原位控制调节膜组成的方法，人们对于单个脂质生物学功能的了解一直受到阻碍。在这里，我们提出了一种编辑磷脂的策略，磷脂是生物膜中最丰富的脂质。我们的膜编辑器基于细菌磷脂酶 D (PLD)，它通过水或外源醇对磷脂酰胆碱进行水解或转磷脂酰化来交换磷脂头部基团。利用哺乳动物细胞中活性依赖性的定向酶进化，我们开发并从结构上表征了一个“超级PLD”家族，其活性比野生型 PLD 高 100 倍。我们证明了超级PLD 在活细胞中特定细胞器膜内光遗传学编辑磷脂以及体外生物催化合成天然和非天然设计磷脂的实用性。除了超级PLD之外，哺乳动物细胞中基于活动的定向酶进化是一种可推广的方法，可以设计出额外的化学酶生物分子编辑器。
哺乳动物脑中多晶镜神经元的突触和电路功能
哺乳动物脑中的神经元不限于释放单个神经递质，而是通常将神经递质的神经递质释放到突触后细胞上。在这里，我们回顾了整个哺乳动物中枢神经系统中发现的多晶月神经元的最新发现。我们重点介绍了最新的技术创新，这些创新使新的多晶镜神经元及其突触特性的研究成为可能。我们还专注于轴突末端和突触囊泡上神经递质corelease所需的机制和分子成分，以及多种晶状体神经元在多种脑电路中的一些可能功能。我们期望这些方法将导致对多晶镜神经元的机制和功能的新见解，它们在电路中的作用以及它们对正常和病理大脑功能的贡献。
哺乳动物和昆虫先天免疫中的 NF-κB 信号通路
先天免疫是抵御感染性微生物的第一道防线。先天免疫系统依靠生殖系编码的模式识别受体 (PRR) 来识别病原体衍生物质 (Janeway 1989)。通过这些受体激活先天免疫系统会导致大量抗菌效应分子的表达，这些分子会在多个不同层面攻击微生物。先天免疫系统在进化早期就出现了，病原体识别和激活反应的基本机制在大部分动物界中都得到了保留 (Hoffmann 等人 1999)。与先天免疫相反，适应性免疫系统通过体细胞 DNA 重排产生抗原特异性受体、抗体和 T 细胞受体。这些受体仅存在于高等真核生物中，可识别特定的病原体编码蛋白质。哺乳动物具有复杂的免疫反应，它依赖于免疫系统的先天和适应性分支之间的交流。先天免疫反应会产生共刺激信号，该信号与抗原特异性识别相结合，可激活 T 细胞和适应性免疫系统。在没有共刺激的情况下，抗原特异性识别会导致无能而不是激活（Janeway 1989）。因此，抗原特异性反应的激活与先天免疫系统的感染有关。昆虫具有非常强大的先天免疫反应，可有效对抗多种病原体。例如，果蝇可以抵抗和清除细菌负担，相对于其大小，这些细菌负担对哺乳动物来说是致命的（Hoffmann 和 Reichhart 1997）。哺乳动物和昆虫中先天免疫的诱导会导致类似的效应机制的激活，例如刺激基于细胞的吞噬活性和抗菌肽的表达（Hoffmann 等人 1999）。例如，果蝇在受到真菌或细菌感染时会产生多种有效的抗菌肽（Hoffmann and Reichhart 1997）。
重新审视BDNF及其受体在哺乳动物发育中的表达
脑衍生的神经营养因子（BDNF）促进了中枢神经系统中神经元的存活和功能，并有助于许多非神经组织的正常功能。尽管已经对BDNF的调节和作用进行了广泛的研究，但缺乏对BDNF及其受体TRKB和P75NTR的表达动力学进行严格的分析。在这里，我们分析了来自18个已发表的RNA测序数据集的3,600多个样品，并使用了来自GTEX的17,000多个样本，以及来自Brainspan数据库的约180个样本来描述BDNF在发育中的乳腺神经和非神经组织中的表达。我们显示了BDNF mRNA的进化保守动力学和表达模式和未经保存的替代5'外显子使用情况。最后，在几种非神经组织中，我们还显示了在鼠大脑发育和BDNF蛋白表达期间的BDNF蛋白水平的增加。并联，我们描述了鼠和人类中BDNF受体TRKB和P75NTR的时空表达模式。总的来说，我们对BDNF表达及其受体表达的深入分析使您可以深入了解整个生物体中BDNF的调节和信号传导。
跨哺乳动物组织的通用DNA甲基化年龄
衰老通常被认为是随机细胞损伤的结果，可以使用DNA甲基化轮廓准确地估计，这是泛组织表观遗传钟的基础。在这里，我们使用了来自哺乳动物甲基化财团的11,754个甲基化阵列，证明了普遍的泛哺乳动物时钟的发展，该甲基化阵列包括185种哺乳动物物种的59种组织类型。这些预测模型以高精度估算哺乳动物组织年龄（r> 0.96）。年龄偏差与人类死亡率风险，小鼠体形轴突变和热量限制相关。我们鉴定出具有甲基化水平的特定细胞，这些甲基化水平随着许多物种而随着年龄的增长而变化。这些位点高度富含多孔抑制性复合物2结合位置，几乎与哺乳动物发育，癌症，肥胖和寿命有关。我们的发现提供了新的证据，表明衰老在进化上是保守的，并与所有哺乳动物的发育过程交织在一起。
利用流体动力在大脑中牵引哺乳动物运动纤毛
运动纤毛广泛分布于动物和植物界，表现出对其生理至关重要的复杂集体动力学。它们的协调机制尚不明确，之前的研究主要集中在藻类和原生生物上。我们在此研究脑室多纤毛细胞中纤毛摆动的牵引。对受控振荡外部流的响应表明，与主动摆动的纤毛频率相似的流动可以牵引纤毛振荡。我们发现这种牵引所需的水动力在很大程度上取决于每个细胞的纤毛数量。与最近在衣藻中观察到的情况相反，纤毛较少的细胞（最多五个）可以在与纤毛驱动流相当的流量下被牵引。实验趋势通过一个模型定量描述，该模型考虑了密集纤毛的流体动力学筛选和鞭毛摆动的化学机械能量效率。纤毛与流体动力学相互作用的最小模型的模拟显示出在纤毛中观察到的相同趋势。
一种一般策略，用于设计高性能哺乳动物全细胞生物传感器
基于转录的全细胞生物传感器（WCB）是由分析物1响应启动子设计的细胞，驱动记者基因的转录。WCB可以感知并报告与人类健康相关的生物活性分子（分析）。设计对分析物敏感的3启动子需要繁琐的试验方法，通常会导致生物传感器4的性能差。在这里，我们将合成生物学与控制工程集成到5个设计，计算模型，并在6个哺乳动物细胞中实现了高性能生物传感器。与传统方法不同，我们的方法不依赖于优化独立的7个视图组件，例如启动子和转录因子。相反，它使用生物分子8电路来增强生物传感器的性能，尽管固有的组件缺陷。我们通过采用CRISPR-CAS系统来仔细地实现了八个不同的生物传感器，然后进行了数量比较的性能，并确定了一种配置，我们将其命名为11个Casense，从而克服了当前生物传感器的局限性。我们的方法是可以推广的12，并且可以适应任何感兴趣的分析物，其中有一个对分析物敏感的13启动子，使其成为多种应用程序的多功能工具。作为概念证明，我们14培养了细胞内铜的高性能生物传感器，这是因为铜15在人类健康和疾病中发挥作用，并且缺乏能够测量细胞内16铜在活细胞中的技术。19我们工作的重要性在于它在体外和体内对17种监测生物活性分子和化学物质的监测的潜力，在18个地区，例如毒理学，药物发现，疾病诊断和治疗中至关重要。
哺乳动物基因组调节和编辑的工程小型CRISPR-CAS系统
紧凑型和多功能的CRISPR-CAS系统将在各种环境中通过高功能交付来实现基因组工程应用。在这里，我们创建了一种通过引导RNA和蛋白质工程设计从V型Cas12f（Cas14）系统设计的有效的微型CAS系统（Casmini），该系统的大小不到当前使用的CRISPR系统（CAS9或CAS12A）的一半。我们证明，Casmini可以驱动高水平的基因激活（最大增加），而天然CAS12F系统无法在哺乳动物细胞中起作用。我们表明，Casmini系统具有与CAS12A相当的基因激活活动，具有高度特定的，并且允许稳健的基础编辑和基因编辑。我们期望Casmini对细胞工程和基因治疗应用具有广泛的用处，并在体内和体内有用。