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利用复杂生物基质中的药物，代谢产物和内源激素的低水平检测的灵敏度提高
在本技术说明中，Sciex 7500系统上的技术创新被利用以提高许多具有挑战性的法医工作流程的灵敏度和总体量化性能。通过比较Sciex 7500系统和上一代仪器QTRAP 6500+系统上观察到的信号来研究这些灵敏度增长的影响。结果显示了检测下限（LLOD）和定量（LLOQ）的改进，这些限制提供了常规，鲁棒检测从具有挑战性的生物矩阵中提取的超低分析物的能力。这种提高的灵敏度还可以使较小的样品和注射体积可显着最大程度地减少矩阵干扰，因此提供了更一致的电离。结果还表明，可以利用增加的灵敏度来简化样本准备程序，从而提高了常规分析的生产率。能够分析这些化合物而无需艰苦且耗时的样本准备程序，提高了整体运营效率和吞吐量，从而使法医测试实验室能够超过其当前的生产率水平。
将标记蛋白敲入 5'UTR 可高效生成稳定细胞系
摘要。表达标记蛋白的稳定细胞系和动物模型是研究细胞和分子行为的重要工具。已经应用了几种分子生物学技术来建立表达标记蛋白的细胞系，并取得了不同程度的成功和效率。在这里，我们应用 CRISPR/Cas9 将标记蛋白敲入内源基因位点的 5'UTR。通过这种 5'UTR 靶向敲入策略，建立了表达 Arl13b-Venus、Reep6-HA 和 EGFP-alpha-tubulin 的稳定细胞系，在抗生素选择的细胞中效率高达 50% 至 80%。敲入蛋白的定位与野生型细胞中内源蛋白的定位相同，并表现出均质表达。此外，从内源启动子敲入的 EGFP-alpha-tubulin 的表达在长期培养中是稳定的。我们进一步证明荧光信号足以进行长时间延时成像。在整个延时成像过程中，荧光信号清晰可见，并显示出特定的亚细胞定位。总之，我们的策略表明 5'UTR 是生成细胞系的合适位点，用于在哺乳动物细胞中稳定表达来自内源位点的标记蛋白。
转基因技术改良作物的三种策略
外源基因的异源表达、内源基因的过度表达和抑制不良基因的表达是转基因技术改良作物的三种策略。截至 2020 年，全球批准商业化推广的作物单个转基因事件（265 个）中，大多数（227 个）都是通过第一种策略开发的。其中 38 个是通过转录反义或双链 RNA 的合成序列转化的，3 个是通过抑制不良基因表达的突变拷贝转化的（第三种策略）。通过第一种和第三种策略，已经开发并批准商业化推广了数百个转基因事件和数千个品种，这些品种对除草剂和杀虫剂的抗性以及营养品质都有显著提高。它们的应用大大减少了合成农药的使用和作物生产成本，提高了作物的产量和农民的收益。然而，除一个育性恢复事件和另一个提高除草剂耐受性的事件外，几乎所有的内源基因过度表达事件都停留在测试阶段。在组成型启动子的控制下异源表达的外源基因所赋予的新功能通常在受体作物中是不存在的或通过不同的途径实现。然而，过量表达的内源基因编码的内源蛋白质受到复杂的网络调控，具有功能冗余和可替换的途径，难以显著地赋予理想的表型。结论是，对于作物的转基因改良而言，外源基因的异源表达和通过 RNA 干扰和成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR/Cas) 抑制不良基因的表达优于内源基因的过量表达。
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鉴于这些结果以及 EFSA 的结论，即定向诱变和同源基因（不包括内源基因）本身不会产生不同于传统育种方法的特定危害，定向替换、插入和缺失（NGT 提案附件一中的标准 1 和 2）、定向插入和替换同源基因（标准 3）以及定向倒位（标准 4）被纳入等同性标准。标准 5 被纳入考虑可能的结果（DNA 序列），这些结果可能发生在育种者基因库 6 中的物种中，但可能未被先前的标准涵盖。该标准仅对标准 3 和基因改造不干扰内源基因的条件进行了豁免。
利用 CRISPR/Cas9 生成内源启动子驱动的荧光素酶报告系统，用于研究核心时钟基因 BMAL1 的转录调控
摘要：人类和其他生物体通过大气、饮用水、食物或直接接触不断接触成千上万种化学物质。这些化学物质中很大一部分浓度很低，即使在未观察到不良影响水平 (NOAEL) 下也可能产生协同作用。复杂的污染物混合物很难通过传统的毒理学方法进行评估。人们越来越关注不同污染物如何通过影响昼夜节律而诱导人体不良的生理功能。然而，从大量化学物质或其复杂混合物中筛选出具有昼夜节律破坏作用的化合物非常困难。我们通过 CRISPR/Cas9 建立了稳定的萤火虫荧光素酶报告基因敲入 U2-OS 细胞系，以筛选昼夜节律破坏污染物。荧光素酶基因插入核心时钟基因 BMAL1 下游并由内源启动子控制。与使用外源启动子的检测系统相比，这些细胞能够检测干扰 BMAL1 基因表达介导的昼夜节律系统的化合物。U2-OS 敲入细胞显示，当用 BMAL1 抑制剂和激活剂处理时，BMAL1 和荧光素酶活性发生了平行变化。此外，荧光素酶报告基因具有高灵敏度，比传统毒理学方法更快、更经济。敲入细胞系可用于高通量、高效筛选破坏昼夜节律的化学物质，例如药物和污染物。
用于目标反卷积和选择性分析的蛋白质组学
Evotec 的化学蛋白质组学方法使用高端定量质谱技术来揭示和验证特定的细胞靶标，在细胞辅助因子和天然复合伙伴存在的情况下，通过对天然、内源表达、翻译后修饰蛋白质进行蛋白质组范围分析来无偏见地识别靶标，Evotec Cellular Target Profiling™ 可识别
dCas9-VP64 变体与介导 CRISPR 激活的多重引导 RNA 的比较分析
CRISPR/Cas9 介导的转录激活 (CRISPRa) 是研究复杂生物现象的有力工具。尽管基于 VP64 转录激活因子的 CRISPRa 方法已在培养细胞和动物模型中得到广泛研究，并且对体内各种细胞类型和发育阶段表现出极大的通用性，但不同的 dCas9-VP64 版本尚未进行严格比较。在这里，我们比较了相同环境下的不同 dCas9-VP64 构建体（包括所用的细胞系和转染条件）激活内源和外源基因的能力。此外，我们研究了将 VP64 添加到基于 VP64 和 p300 的构建体的最佳方法。我们发现 MS2-MCP 支架 VP64 比直接将 VP64 融合到 dCas9 的 N 端更好地增强了基础 dCas9-VP64 和 dCas9-p300 活性。对于所有测试的靶基因，dCas9-VP64+MCP-VP64 和 dCas9-p300+MCP-VP64 均优于 VP64-dCas9-VP64。此外，使用 dCas9-VP64+MCP-VP64 或 dCas9-p300+MCP-VP64 进行多重 gRNA 表达可显著增强内源基因激活，达到与使用单个 gRNA 的 CRISPRa-SAM 相当的水平。我们的研究结果表明 dCas9-VP64 CRISPRa 系统有所改进，有助于开发多功能、高效的 CRISPRa 平台。
有效地递送活性Cas9蛋白和靶标特异性SGRNA到广泛的细胞类型
最后，在悬浮液中生长的Jurkat细胞中，评估了吉赛克的敲除生理相关的内源基因。敲除靶向的CD81，该CD81编码在许多哺乳动物细胞中表达的细胞表面蛋白，并与丙型肝炎，HIV和流感发病机理有关。jurkat细胞用Cas9和CD81特异性SGRNA的表达质粒共转染，或用靶向CD81的Cas9 -Sgrna RNP复合物预加载的gesiles处理。通过抗体标记评估CD81的基因敲除效率，然后进行流式细胞仪分析（图4）。基于质粒的递送导致效率非常低。只有7％的细胞损失CD81表达。相反，吉塞拉（Gesicles）具有很高的效率，其中76％的Jurkat细胞缺乏可检测到的CD81水平。因此，吉质的表现优于基于质粒的技术，具有在难以转化细胞中有效靶向内源基因的能力。
研讨会传单
嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗在实体瘤中的功效受到免疫抑制和抗原异质性的限制。为了克服这些障碍，已经开发了分泌促炎细胞因子的“装甲”汽车T细胞。但是，由于与装甲转基因的外围表达有关的毒性，它们的临床应用受到限制。在这里，我们制定了一种CRISPR敲门策略，该策略利用内源基因的调节机制以肿瘤局部方式驱动转基因表达。通过筛选具有肿瘤限制表达的内源基因，NR4A2和RGS16启动子被鉴定出来，以支持直接进入肿瘤部位的细胞因子（例如IL-12和IL-2）的递送，从而增强了抗肿瘤功效，并增强了抗肿瘤的功效和长期生存，以及在合基因和Xenogeneic模型中小鼠的长期存活。这与改善的CAR T细胞多功能性，内源性抗肿瘤免疫力的激活，有利的安全性，并且使用患者的CAR T细胞适用。