亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用不含钙和镁的PBS洗涤它们。将T25活塞3-5毫升PBS和T75活塞使用5-10毫升。然后将细胞完全用ACCUTASE覆盖,其中T25活塞的1-2 mL和T75活塞的2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以更换它们。孵育后,将细胞与10 ml培养基仔细混合以使它们共振,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,在新鲜培养基中产生共鸣,并将其转换为已经包含新鲜培养基的新活塞。
图2。合成,表征和DBCO修饰脂质体的体外靶向效应。(a)DBCO修饰的脂质体合成DSPE-PEG 2000 -DBCO,DOPC和胆固醇的示意图。使用DSPE-PEG 2000合成未修饰的脂质体。(b)DBCO-LIPO的大小和Zeta电位。(c)DOX和R837混合物的HPLC痕迹或dox/r837的提取物的提取物。将检测波长设置为254 nm。(d)在(c)中〜6.5分钟时检测到的DBCO脂质的UV吸收光谱。(E)用AC 4 Mannaz或PBS预处理的4T1细胞的共聚焦图像48小时,然后与DID封闭的DBCO-LIPO孵育30分钟。比例尺:10μm。(f)用AC 4 Mannaz或PBS预处理的4T1细胞的平均CY5荧光强度48小时,然后与DID封闭的DBCO-LIPO(2 mg/ml)孵育30分钟。(g)用AC 4 Mannaz预处理的4T1细胞的平均CY5荧光强度,然后与不同浓度的DID封闭DBCO-LIPO孵育30分钟。所有数值数据均表示为平均值±SD(0.01 < *p≤0.05; **p≤0.01; ***p≤0.001)。
请注意:根据这些比例,可以扩大此反应(使用更多珠子)。4. 在 42°C 下孵育至少 1 小时。定期用手轻轻搅拌珠子。
亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用缺乏钙和镁的PBS洗涤它们。对于T25烧瓶,使用3-5毫升PBS,对于T75烧瓶,使用5-10毫升。然后,使用1-2 mL对T25烧瓶完全覆盖细胞,T75烧瓶2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以将其分离。孵育后,将细胞与10 ml培养基轻轻混合以重悬于它们,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重悬于新鲜培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。
亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用缺乏钙和镁的PBS洗涤它们。对于T25烧瓶,使用3-5毫升PBS,对于T75烧瓶,使用5-10毫升。然后,使用1-2 mL对T25烧瓶完全覆盖细胞,T75烧瓶2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以将其分离。孵育后,将细胞与10 ml培养基轻轻混合以重悬于它们,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重悬于新鲜培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。
亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用缺乏钙和镁的PBS洗涤它们。对于T25烧瓶,使用3-5毫升PBS,对于T75烧瓶,使用5-10毫升。然后,使用1-2 mL对T25烧瓶完全覆盖细胞,T75烧瓶2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以将其分离。孵育后,将细胞与10 ml培养基轻轻混合以重悬于它们,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重悬于新鲜培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。
亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用缺乏钙和镁的PBS洗涤它们。对于T25烧瓶,使用3-5毫升PBS,对于T75烧瓶,使用5-10毫升。然后,使用1-2 mL对T25烧瓶完全覆盖细胞,T75烧瓶2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以将其分离。孵育后,将细胞与10 ml培养基轻轻混合以重悬于它们,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重悬于新鲜培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。
功能活性(粘性终端连接):20μl含有0.5 µL快速T4 DNA连接酶,12μgHindiii消化的lambda DNA和1x T4 DNA连接酶在37°C下孵育37°C,过夜,由Agarose gelorophoresis确定的片段,在> 95%的片段中,> 95%的片段。重新消化的连接产物,50μl反应,其中含有6μg连接的片段,40个单位Hindiii和1x的Nebuffer 2在37°C下孵育2小时,导致未检测到的未检测到的未发现的片段,因为琼脂糖凝胶电基果实确定。
亚培养从粘附细胞中去除旧培养基,并用无钙和镁的PBS洗涤它们。使用3-5 mL PBS进行T25烧瓶,T75烧瓶使用5-10 mL。然后用ACCUTASE完全疲倦,T25 Colber用1-2 mL和T75烧瓶的2.5 mL静止。让细胞在室温下孵育8-10分钟以松开它们。孵育后,将细胞与10 ml培养基轻轻混合以使其恢复它们,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重悬于新培养基中,然后将其转移到已经包含新培养基的新瓶中。
亚培养物从粘附细胞中去除旧培养基,并用缺乏钙和镁的PBS洗涤它们。对于T25烧瓶,使用3-5毫升PBS,对于T75烧瓶,使用5-10毫升。然后,使用1-2 mL对T25烧瓶完全覆盖细胞,T75烧瓶2.5 mL。让细胞在室温下孵育8-10分钟以将其分离。孵育后,将细胞与10 ml培养基轻轻混合以重悬于它们,然后以300xg离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重悬于新鲜培养基中,然后将其转移到已经包含新鲜培养基的新瓶中。