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World File Search System敲除
2025; 21（5）：2360-2379。 doi：10.7150/ijbs.106468通过RPN1敲除精子细胞中N-糖基化的研究论文失调会诱导男性INF
1。山东大学妇女，儿童和生殖健康研究所，中国250012。2。国家繁殖医学和后代健康的主要实验室，妇女，儿童与生殖健康研究所，山东大学，250012，中国。3。国家辅助生殖技术与生殖遗传学研究中心，山东大学，吉南，山东，250012，中国。4。繁殖内分裂症的主要实验室（山东大学），教育部，吉南，山东，250012，中国。5。Shandong Technology Innovation for Gredoductive Health，Jinan，Shandong，250012，中国。6。山东省临床临床研究中心，吉南，山东，250012，中国。7。Shandong的生殖研究和预防先天缺陷的主要实验室，Jinan，Shandong，250012，中国。8。中国医学科学院（No.2021RU001）的Art-Offspring的配子发生和健康研究单位，中国250012，Jinan，Shandong。9。基础医学科学学院，山东大学，吉南250012，中国。10。国家蛋白质组学医学蛋白质组学的主要实验室，北京蛋白质科学中心（北京），北京生命学研究所，中国北京102206。11。中国山东大学山东大学切鲁大学医学院第二医院生殖医学中心，中国山东250012。12。13。14。广州广州妇女和儿童医疗中心，广州，广州，510623，中国。Cuhk-SDU生殖遗传学联合实验室，中国香港中国大学生物医学科学学院，中国香港。繁殖与遗传学中心，妇产科系，USTC第一家附属医院，生命科学与医学部，中国科学技术大学，Hefei，Hefei，Anhui，Anhhui，230001，中国。
基于单细胞打印技术和乳液偶联分析对 CRISPR/Cas9 RANKL 敲除间充质干细胞克隆进行表征，作为单细胞克隆的低细胞工作流程
基因改造单细胞的同质性对于许多应用（例如细胞系开发、基因治疗和组织工程，尤其是再生医学应用）而言是必需的。缺乏有效分离和表征 CRISPR/Cas9 工程细胞的工具被认为是这些应用中的一个重大瓶颈。尤其是蛋白质检测技术不兼容，无法在没有先决条件大规模克隆扩增的情况下确认蛋白质表达变化，这在许多应用中造成了僵局。为了改善工程细胞的表征，我们提出了一种改进的工作流程，包括基于高产量荧光特性的单细胞打印/分离技术、基因组编辑筛选（测量测定）、评估改变的基因表达的 mRNA rtPCR 和一种称为乳化偶联的多功能蛋白质检测工具，以提供高含量、统一的单细胞工作流程。该工作流程以 RANKL 敲除永生化间充质干细胞的工程和功能验证为例，这些细胞的骨形成能力发生了改变。由此产生的工作流程经济实惠，无需大规模克隆扩增细胞，整体克隆效率高于 CRISPR/Cas9 编辑细胞的 30%。尽管如此，由于单细胞克隆在细胞发育的早期高度并行阶段得到全面表征，包括 DNA、RNA 和蛋白质水平，因此该工作流程可提供更多成功编辑的细胞以供进一步表征，从而降低开发过程中后期失败的可能性。
基于 CRISPR-Cas9 的模型褐藻 Ectocarpus 中的靶向基因敲除
HAL 是一个多学科开放存取档案库，用于存放和传播科学研究文献，无论这些文献是否已出版。这些文献可能来自法国或国外的教学和研究机构，也可能来自公共或私人研究中心。
利用 CRISPR–Cas9 对玉米进行单基因和多基因敲除
玉米具有双重作用，既是主要作物品种，又是遗传学中的模式物种。经过基因组编辑的糯玉米的特点是改性淀粉完全由支链淀粉组成，这是首批使用 CRISPR-Cas9 技术编辑的作物之一，获得了美国农业部批准种植和销售而无需进行转基因监督 (Waltz 2016)。这个例子说明了人们对 CRISPR-Cas9 技术在应用和基础研究中的潜力有着浓厚的兴趣。几十年来，淀粉行业一直很欣赏糯玉米，因为没有直链淀粉可以使淀粉更易于加工。虽然糯性状并不新颖，但 CRISPR-Cas9 技术可以在一到两代内直接在优良品系中产生糯性缺失，从而避免了传统基因渗入过程中耗时的回交和遗传拖累 (Cigan 等人 2017)。
建立 GPR146 敲除人类诱导多能干细胞系 (ITXi001-A-1)
动脉粥样硬化性心血管疾病 (ASCVD) 仍然是全球最大的死亡原因 2 。血脂异常是与 ASCVD 发展有关的一个关键的可改变的因果风险因素。最近，G 蛋白偶联受体家族的成员 G 蛋白偶联受体 146 (GPR146) 被证明是血浆胆固醇的调节剂 3,4 。GPR146 在小鼠体内的肝脏抑制已显示出良好的特性，它对高胆固醇血症和动脉粥样硬化具有保护作用，这种作用独立于低密度脂蛋白受体 (LDLR) 通路 3 。为了更好地理解所涉及的生物学机制，我们开发了一种先进的基因工程人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 模型，该模型因 GPR146 而无效。 GPR146 -/- 细胞系 (ITXi001-A-1) 源自我们实验室先前从尿液祖细胞 (ITXi001-A) 1 中重新编程的对照 hiPSC 的基因组版本。基因组版本使用 Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统 (Integrated DNA Technologies) 进行，针对两个等位基因上的 GPR146 外显子 2。ITXi001-A-1 是通过挑选单个菌落建立的，其基因型通过 PCR 筛选 (图 1A - 上图和下图) 并通过 Sanger 测序确认 (图 1B)。我们进一步表明，GPR146 基因的遗传版本不会诱导基因组的脱靶版本（筛选 10 个预测位点 - （补充文件 3A）），也不会诱导 ITXi001-A-1 细胞的基因组完整性（分析 24 个拷贝数变异）（补充文件 1）。我们验证了 ITXi001-A-1 细胞不含支原体（补充文件 3B），并且它们与最初采集的尿液细胞来自同一个体（16 个 STR 的亲子鉴定 - 补充文件 2）。总体而言，ITXi001-A-1 细胞呈现：I- 与 ITXi001-A 细胞相比具有相似的形态（图 1C）II- 多能性标志物的阳性表达（通过 OCT3/4 和 TRA-1–60 的免疫荧光染色检测）（图 1D）。 III- 多能性细胞表面标志表达阳性（流式细胞术检测 SSEA-4 和 TRA1-60）（图 1E）。IV- 多能性标志物的表达水平与 ITXi001-A 细胞相同（NANOG、POU5F1 和 SOX2 - 通过 RT-qPCR 测量）（图 1F）。V- 具有优异的分化为中胚层、内胚层和外胚层的能力（通过 SOX17 和 FOXA2（中胚层）；T(TBXT) 和 HAND1（内胚层）以及 PAX6 和 SOX1（外胚层）的 RT-qPCR 评估，与 ITXi001-A 细胞相似）（图 1G）。
HLA-A/B/C敲除电穿孔套件
说明HLA-A/B/C敲除电穿孔套件适用于通过电穿孔的细胞系和原代T细胞工程。该套件既包含Cas9酶（链球菌）和靶向HLA-A/B/C（人白细胞抗原）的GRNA。该套件足以设计高达500万个原代T细胞。背景HLA（人白细胞抗原）-a，b和c是MHC的三种主要类型（主要的组织相容性复合物）1类跨膜蛋白。它们与β2微球蛋白蛋白（由B2M基因编码）形成异二聚体。MHC 1类分子表现出短多肽，通常在长7-11个氨基酸之间，以识别为“自我”或“非自身”的免疫系统。HLA-C存在于所有细胞中，并且由于HLA-C基因的多样性而作为几种单倍型存在。c*08：02代表一种这样的单倍型。HLA I类将新抗原衍生的肽呈现到细胞表面，从而通过TCR（T细胞受体）识别出T细胞的识别。 癌症免疫疗法一直在使用该机制，方法是表达能够识别特定癌症免疫原子的TCR。 在2016年，HLA-C*08：02限制性TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）在肺癌中靶向KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒）G12D突变，导致阳性结果。 在转移性胰腺癌患者中采用了类似的方法，并导致该疾病的消退。 HLA-C*08：02限制性TIL对其他新抗原的TCR的研究可能对癌症治疗有益。 应用程序HLA I类将新抗原衍生的肽呈现到细胞表面，从而通过TCR（T细胞受体）识别出T细胞的识别。癌症免疫疗法一直在使用该机制，方法是表达能够识别特定癌症免疫原子的TCR。在2016年，HLA-C*08：02限制性TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）在肺癌中靶向KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒）G12D突变，导致阳性结果。在转移性胰腺癌患者中采用了类似的方法，并导致该疾病的消退。HLA-C*08：02限制性TIL对其他新抗原的TCR的研究可能对癌症治疗有益。应用程序K562细胞是HLA I和II类负的，使其成为引入和研究特定单倍型响应的理想细胞模型。hla在供体细胞和个体之间的不匹配可以导致免疫排斥反应，一种选择是敲除内源性HLA，从而使细胞被更广泛地普遍使用。
慢性粒细胞白血病的基因组规模 CRISPR 敲除筛选发现了新的耐药机制以及内在的细胞凋亡和 MAPK 信号传导
摘要 了解癌症的耐药机制对于发现新的“可用药”靶点至关重要。高效的基因筛选是解释新细胞过程（如癌症治疗耐药性）的重要工具，而如今，借助 CRISPR-Cas9 基因编辑技术、下一代测序和生物信息学，这种筛选现在变得更加可能。伊马替尼通过靶向和阻断 BCR-ABL1 的激酶活性来特异性消除慢性粒细胞白血病 (CML) 细胞；然而，仍然存在对治疗的耐药性。为了发现不依赖于 BCR-ABL1 的伊马替尼耐药机制，我们利用基因组规模的 CRISPR 敲除文库在 K562 细胞上体外筛选伊马替尼敏感基因。我们发现了一些似乎对伊马替尼诱导的细胞死亡至关重要的基因，例如促凋亡基因 (BIM、BAX) 或 MAPK 抑制剂 SPRED2。具体而言，使用 BH3 类似物重建 BIM 敲除 (KO) 细胞中的细胞凋亡，或使用 MEK 抑制剂抑制 SPRED2 KO 细胞中的 MAPK 信号传导，可恢复对伊马替尼的敏感性。在这项研究中，我们发现了之前确定的调节 CML 细胞系对伊马替尼反应的途径和新途径，例如 Mediator 复合物、mRNA 加工和蛋白质泛素化的影响。使用联合疗法针对这些特定的基因病变可以克服耐药表型，并为精准肿瘤学的应用铺平道路。
利用病毒复制子进行全基因组 CRISPR 敲除筛选，以鉴定参与病毒复制的宿主因子
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2025 年 1 月 11 日发布。；https://doi.org/10.1101/2025.01.09.632058 doi：bioRxiv 预印本
使用病毒复制子进行全基因组 CRISPR 敲除筛选 1
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是由此预印本的版权持有者于 2025 年 1 月 11 日发布的。 ; https://doi.org/10.1101/2025.01.09.632058 doi：bioRxiv 预印本