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通过预复合的 CRISPR-Cas9/sgRNA 核糖核蛋白避开细胞抑制 RNA，实现高效的 ssODN 介导靶向
结合 CRISPR-Cas9 技术和单链寡脱氧核苷酸 (ssODN)，可以在诱导性多能干细胞 (iPSC) 中的目标基因组位点引入特定的单核苷酸改变；然而，与缺失诱导相比，ssODN 敲入频率较低。尽管已报道了几种 Cas9 转导方法，但是 CRISPR-Cas9 核酸酶在哺乳动物细胞中的生化行为仍有待探索。在这里，我们研究了影响 Cas9 体外裂解活性的内在细胞因素。我们发现细胞内 RNA（而不是 DNA 或蛋白质部分）会抑制 Cas9 与单向导 RNA (sgRNA) 结合并降低酶活性。为了防止这种情况，与 Cas9 过表达方法相比，在递送到细胞之前预复合 Cas9 和 sgRNA 可产生更高的基因组编辑活性。通过优化预复合核糖核蛋白和ssODN的电穿孔参数，我们实现了高达70%的单核苷酸校正效率和高达40%的loxP插入效率。最后，我们可以用C2等位基因替换HLA-C1等位基因，以生成组织相容性白细胞抗原定制编辑的iPSC。
ReMOT 控制递送 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物以诱导疾病媒介蚊子淡色库蚊的种系诱变
淡色库蚊复合体分布广泛，导致蚊媒疾病在人类中的传播难以预防。使用 CRISPR/Cas9 基因编辑是一种有效的技术，有可能解决日益严重的蚊媒疾病问题。本研究利用 ReMOT 控制技术在淡色库蚊中生产转基因蚊子。通过注射 60 只成年雌蚊建立了显微注射系统——需 14 µ l 注射混合物，使用≤1 µ l 的内体释放试剂（氯喹或皂苷）不会发生沉淀。在采血后 24 小时（卵黄发生高峰期）注射 P2C 增强型绿色荧光蛋白-Cas9（P2C-EGFP-Cas9）核糖核蛋白复合物进入卵巢的效率为 100%。利用此方法进行KMO敲除，我们发现当通过ReMOT Control将P2C-Cas9 RNP复合物注射到淡色库蚊成年血淋巴中时，卵巢中也能发生基因编辑。在氯喹组，筛选出的2,251只G 0 子代中，9只个体表现出白眼和马赛克眼表型。在皂苷组，筛选出的2,462只G 0 子代中，观察到8只突变个体。测序结果显示13 bp的缺失，进一步证实了发生基因编辑的事实。总之，ReMOT Control在淡色库蚊中的成功应用，不仅为该方法提供了基本参数（注射参数和注射时间），而且有利于蚊虫生物学和防治的研究。
基于吸附性二氧化硅纳米结构的体内递送增强治疗性核糖核蛋白的基因编辑和碱基编辑
基因组编辑工具广泛安全应用的关键是将核糖核蛋白 (RNP) 的多种成分安全有效地递送到单细胞中，但这仍是其临床应用的生物障碍。为了解决这个问题，设计了一种基于生物相容性海绵状二氧化硅纳米结构 (SN) 的强大 RNP 递送平台，用于储存和直接递送治疗性 RNP，包括 Cas9 核酸酶 RNP (Cas9-RNP) 和碱基编辑器 RNP (BE-RNP)。与基于脂质的方法等商业化材料相比，通过靶向各种细胞和基因，可获得高达 50 倍的基因删除和 10 倍的碱基替换效率，且脱靶效率低。特别是，通过体内实体瘤模型中的静脉注射和小鼠眼中视网膜下注射的基于 SN 的递送成功诱导基因校正。此外，由于其毒性低、生物降解性高，SN 对器官细胞功能的影响微乎其微。由于工程化的 SN 可以克服与治疗性 RNP 应用相关的实际挑战，因此人们强烈期望该平台能够成为模块化 RNP 递送系统，从而促进体内基因删除和编辑。
RBM20 获得功能性心肌病突变重新连接剪接调控并重新分配处理体内的核糖核蛋白颗粒
心脏剪接因子 RBM20 的突变会导致恶性扩张型心肌病 (DCM)。为了了解 RBM20 相关 DCM 的机制，我们设计了具有 DCM 相关 RBM20 错义突变的同源 iPSC 以及 RBM20 敲除 (KO) iPSC。由这些细胞系制成的 iPSC 衍生的工程心脏组织重现了 RBM20 相关 DCM 的收缩功能障碍，并且显示错义突变的功能障碍比 KO 更严重。通过 eCLIP 对 RBM20 RNA 结合的分析表明，突变型 RBM20 对与肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和加工体相关 RNA 结合蛋白 (FUS、DDX6) 共享的 3′UTR 序列具有功能获得偏好。深度 RNA 测序表明，RBM20 R636S 突变体具有独特的基因、剪接、多聚腺苷酸化和环状 RNA 缺陷，与 RBM20 KO 不同。超分辨率显微镜验证了突变体 RBM20 保持非常有限的核定位潜力；相反，突变蛋白在基础条件下与细胞质加工体 (DDX6) 结合，在急性应激后与应激颗粒 (G3BP1) 结合。总之，我们的结果强调了通过剪接依赖和非剪接途径导致心脏疾病的致病机制。
核糖测序、免疫肽组学和蛋白质组学能告诉我们有关非规范蛋白质组的哪些信息？
核糖体分析 (Ribo-Seq) 揭示了目前注释的编码序列 (CDS) 之外的数千个非规范核糖体翻译位点，从而改变了我们对人类基因组和蛋白质组的理解。保守估计至少有 7000 个非规范 ORF 被翻译，乍一看，这有可能将人类蛋白质 CDS 的数量扩大 30%，从约 19,500 个注释的 CDS 增加到超过 26,000 个注释的 CDS。然而，对这些 ORF 的进一步审查提出了许多问题，即它们中有多少部分真正产生了蛋白质产物，又有多少部分可以根据对该术语的传统理解理解为蛋白质。进一步复杂化的是，已发表的非规范 ORF 估计值相差约 30 倍，从几千到几十万。这项研究的总结让基因组学和蛋白质组学界既对人类基因组中新编码区域的前景感到兴奋，又在寻找如何继续的指导。在这里，我们讨论了非规范 ORF 研究、数据库和解释的现状，重点是如何评估给定的 ORF 是否可以说是“蛋白质编码”。
利用 CRISPR-Cas9 和体外组装的核糖核蛋白操纵全局调节器 mcrA 上调温曲霉中的次级代谢产物
摘要：丝状真菌基因组测序表明，大多数次级代谢物生物合成基因簇 (BGC) 在标准实验室条件下处于沉默状态。在这项研究中，我们在温氏曲霉中建立了一个体外 CRISPR-Cas9 系统。为了激活原本沉默的 BGC，我们删除了负转录调节因子 mcrA 。当菌株在马铃薯葡萄糖培养基 (PDA) 上培养时，mcrA (mcrA Δ) 的缺失导致总共产生 17 种 SM。在 15 种 SM 中，有 9 种已得到充分表征，包括大黄素 ( 1 )、大黄酸乙酯 ( 2 )、sulochrin ( 3 )、大黄酸乙酯二蒽酮 ( 4 )、14- O-脱甲基sulochrin ( 5 )、( 反式 / 顺式 )-大黄素二蒽酮 ( 6 和 7 ) 和 ( 反式 / 顺式 )-大黄素大黄酸乙酯二蒽酮 ( 8 和 9 )。经发现，这些化合物均由相同的聚酮合酶 (PKS) BGC 产生。随后，我们在 mcrA Δ 背景下针对该 PKS 簇进行了二次敲除。双敲除菌株的代谢物谱揭示了先前未在 mcrA Δ 亲本菌株中检测到的新代谢物。从双敲除菌株中纯化出另外两种 SM，并被鉴定为曲霉酸 B ( 16 ) 和一种结构相关但之前未鉴定的化合物 ( 17 )。这项工作首次提出了一种能够在 A.wentii 中进行靶向基因编辑的简便遗传系统。这项工作还说明了进行双敲除以消除主要代谢产物的实用性，从而能够发现更多的 SM。■ 简介
方案优化 CRISPR-Cas9/gRNA 核糖核蛋白复合物的电穿孔，用于人类多能干细胞中的无选择同源重组
d. 将培养板放入 37 C 培养箱中并孵育 10 分钟。每 3-4 分钟轻轻摇晃培养板一次有助于完全分离细胞。 e. 加入 1 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基，并轻轻吹打细胞直至 iPSC 完全分离。 f. 计数细胞，并将 1.0 3 10 4 –1.5 3 10 4 个细胞接种到 iMatrix 涂层的 6 孔板中，该板含有 2 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基，如步骤 cg 中所述，将细胞在 37 C 的 CO 2 培养箱中孵育过夜。 h. 第二天，用 2 mL StemFit 培养基更换培养基。如果有很多死细胞漂浮，继续向培养基中添加 Y-27632，最终浓度为 10 m M。 i.培养期间每 2 天更换一次培养基。j. iPSC 在第 6-8 天将达到半汇合状态。切勿让它们过度汇合。“半汇合”是指 iPSC 菌落直径小于 2 毫米，并且 iPSC 菌落之间仍有一些间隙。生长速度取决于 iPSC 系，因此应通过实验确定半汇合时间。
斑马鱼胚胎显微注射 - NET
此方案是使用已停产的 Cas9 蛋白版本 (Alt-R Sp Cas9 Nuclease 3NLS) 开发的。目前可用的产品 (Alt-R Cas9 Nuclease V3) 具有改进的 NLS，应以相同的体积和浓度直接替换到此方案中。IDT 建议使用 Alt-R™ Sp Cas9 Nuclease V3 与 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 和 tracrRNA 结合使用，以生成核糖核蛋白编辑复合物，从而在大多数目标位点上实现高编辑效率。查看 Alt-R CRISPR-Cas9 用户指南，了解如何将核糖核蛋白转染哺乳动物细胞系（可在 www.idtdna.com/CRISPR 上找到）。