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World File Search System电穿孔
电穿孔后跨膜电压的长期变化受非选择性漏电流和离子通道活化之间的相互作用控制
电穿孔会导致细胞膜通透性暂时增加，并导致兴奋细胞和非兴奋细胞的跨膜电压 (TMV) 发生长时间变化。然而，这些 TMV 变化的机制仍有待完全阐明。为此，我们使用 FLIPR 膜电位染料将两种不同的细胞系暴露于单个 100 µ s 电穿孔脉冲后，在 30 分钟内监测 TMV。在表达极低水平内源性离子通道的 CHO-K1 细胞中，脉冲暴露后的膜去极化可以用非选择性漏电流来解释，这种漏电流一直持续到膜重新密封，使细胞能够恢复其静止的 TMV。在表达多种不同离子通道的 U-87 MG 细胞中，我们意外地观察到初始去极化阶段之后的膜超极化，但仅在 33 ◦ C 时发生，而在 25 ◦ C 时未发生。我们开发了一个理论模型，该模型得到了离子通道抑制剂实验的支持，该模型表明超极化在很大程度上可归因于钙激活钾通道的激活。离子通道激活与 TMV 和细胞内钙的变化相结合，参与各种生理过程，包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡。因此，我们的研究表明离子通道可能是影响电穿孔后生物反应的潜在靶点。
方案优化 CRISPR-Cas9/gRNA 核糖核蛋白复合物的电穿孔，用于人类多能干细胞中的无选择同源重组
d. 将培养板放入 37 C 培养箱中并孵育 10 分钟。每 3-4 分钟轻轻摇晃培养板一次有助于完全分离细胞。 e. 加入 1 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基，并轻轻吹打细胞直至 iPSC 完全分离。 f. 计数细胞，并将 1.0 3 10 4 –1.5 3 10 4 个细胞接种到 iMatrix 涂层的 6 孔板中，该板含有 2 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基，如步骤 cg 中所述，将细胞在 37 C 的 CO 2 培养箱中孵育过夜。 h. 第二天，用 2 mL StemFit 培养基更换培养基。如果有很多死细胞漂浮，继续向培养基中添加 Y-27632，最终浓度为 10 m M。 i.培养期间每 2 天更换一次培养基。j. iPSC 在第 6-8 天将达到半汇合状态。切勿让它们过度汇合。“半汇合”是指 iPSC 菌落直径小于 2 毫米，并且 iPSC 菌落之间仍有一些间隙。生长速度取决于 iPSC 系，因此应通过实验确定半汇合时间。
1。单细胞定量表达报告（SCQERS）
●将细胞和质粒混合到预燃烧的（ICE）1毫米比色杯以进行电穿孔（例如），非常小心地避免气泡（如果需要时，可以避免使用气泡，以避免气泡，移液器<25 ul）。将比色杯保持在冰上。●电塑料（例如Biorad Gene脉冲器，2 kV，200 𝛀，25 UF）。点击比色杯以消除气泡，并先用吸收纸从比色杯中擦拭冰/水。时间常数应在4.0至4.3 ms范围内。短时常数带有火花，表明出现问题。如果发生这种情况，请重复，减少质粒的量并注意气泡。●成功进行电穿孔后，立即添加475 UL恢复介质（例如SOC），转移到1.5 ml管，并在37℃下摇动。●串行稀释电穿孔，板块在氨苄青霉素板上的转化为0.1％，以评估转化效率。●您可以将电穿孔的细胞保持在4C，直到确认高效率，也可以用氨苄青霉素在LB中过夜（通常在250毫升250 mL烧瓶中，37C，37C，轨道振荡器200 rpm）。●确认高效率后（您应该在0.1％板中看到> 1000个菌落，对应于1m> 1m的转化剂），制作甘油库存以备将来使用，并通过mini或MIDI Prep纯化质粒或MIDI PREP，适用于下游克隆
利用 NxT 的最佳技术进行转染 - Rhenium Bio
图 3. Neon NxT 重悬基因组编辑缓冲液在不同细胞类型和靶标的 CRISPR-Cas9 基因组编辑实验中的表现。靶标位点包括 Jurkat 和 K562 细胞的 ACTN、活化原代 T 细胞的 TRAC、HSC 的 B2M 和原代 NK 细胞的 AAVS1。细胞在 10 µL 或 100 µL 反应中进行电穿孔。(A) GFP 供体 DNA 敲入效率报告为 GFP 阳性细胞的百分比。(B) GFP 供体 DNA 敲入后的细胞活力。(C) 敲除效率报告为与未处理对照相比特定靶标位点的减少百分比。对于原代 NK 细胞，通过基因组切割检测 (GCD) 测定确定的插入/缺失效率 (%) 可作为敲除效率的指标。(D) 敲除细胞的电穿孔后活力。
安捷伦 2024 定价
价格 200123 TG1 电穿孔感受态细胞 5 x 0.1 毫升 279.00 美元 200129 XL1-红色感受态细胞 5 x 0.2 毫升 511.00 美元 200130 XL1-蓝色亚克隆级感受态细胞 8 x 0.5 毫升 105.00 美元 200131 BL21(DE3) 感受态细胞 5 x 0.2 毫升 141.00 美元 200132 BL21(DE3) pLysS 感受态细胞 5 x 0.2 毫升 202.00 美元 200133 BL21 感受态细胞 5 x 0.2 毫升 202.00 美元 200134 TKB1 感受态细胞 5 x 0.2 毫升 471.00 美元200150 XL2-Blue 超感受态细胞 10 x 0.1 毫升 209.00 美元 200151 XL2-Blue MRF' 超感受态细胞 10 x 0.1 毫升 299.00 美元 200152 SURE 2 超感受态细胞 10 x 0.1 毫升 188.00 美元 200154 BJ5183 电穿孔感受态细胞 5x 100 微升 321.00 美元 200157 BJ5183-AD-1 电穿孔感受态细胞 5x 100 微升 411.00 美元 200158 XL1-Blue MRF' 电穿孔感受态细胞 5 x 0.1 毫升 279.00 美元 200159 EletroTen-Blue电穿孔感受态细胞 5 x 0.1 毫升 280.00 美元 200160 ABLE 电穿孔感受态细胞试剂盒 1 套 480.00 美元 200172 ABLE K 感受态细胞 5 x 0.2 毫升 303.00 美元 200207 Gigapack III XL 包装提取物 4 次反应 441.00 美元 200209 Gigapack III XL 包装提取物 11 次反应 881.00 美元 200221 Transpack 包装提取物，100 次反应 100 次反应 4,234.00 美元 200227 SURE 电穿孔感受态细胞 5 x 0.1 毫升 278.00 美元 200228 XL1-Blue 电穿孔感受态细胞 5 x 0.1 毫升 195.00 美元200229 XL1-Blue MR 超级感受态细胞 5 x 0.2 毫升 179.00 美元 200231 SCSI 超级感受态细胞 5 x 0.2 毫升 258.00 美元 200232 AG1 感受态细胞 5 x 0.2 毫升 186.00 美元 200234 JM101 感受态细胞 5 x 0.2 毫升 186.00 美元 200235 JM109 感受态细胞 5 x 0.2 毫升 186.00 美元 200236 XL1-Blue 超级感受态细胞 5 x 0.2 毫升 179.00 美元 200238 SURE 感受态细胞 5 x 0.2 毫升 269.00 美元 200239 JM110 感受态细胞5 x 0.2 mL 219.00 $ 200247 SCS110 感受态细胞 5 x 0.2 mL 219.00 $ 200249 XL1-Blue 感受态细胞 5 x 0.2 mL 124.00 $ 200314 XL10-Gold 超感受态细胞，5 x 100 ul 5 x 0.1 mL 148.00 $ 200315 XL10-Gold 超感受态细胞，10 x 100 ul 10 x 0.1 mL 212.00 $ 200415 脱氧核苷酸混合物，PCR 级 400 ul 151.00 $ 200435 10x Taq DNA 聚合酶缓冲液 10 mL 119.00 $ 200436 AffinityScript 多温度 cDNA 合成试剂盒 50 次反应 242.00 美元 200473 RAT 抗 DYKDDDDK 标签抗体，200 ug 200 ug 235.00 美元 200474 RAT 抗 DYKDDDDK 标签抗体，1 mg 1 mg 399.00 美元 200514 QuikChange 多位点定向诱变试剂盒 30 次反应 1,188.00 美元 200515 QuikChange 多位点定向诱变试剂盒 10 次反应 465.00 美元 200516 QuikChange XL 位点定向诱变试剂盒 30 次反应 855.00 美元 200517 QuikChange XL 位点定向诱变试剂盒 10 次反应 239.00 美元200518 QuikChange 定点诱变试剂盒 30 次反应 608.00 美元 200519 QuikChange 定点诱变试剂盒 10 次反应 239.00 美元 200521 QuikChange II XL 定点诱变试剂盒 10 次反应 239.00 美元 200522 QuikChange II XL 定点诱变试剂盒 30 次反应 608.00 美元 200523 QuikChange II 定点诱变试剂盒 10 次反应 239.00 美元 200524 QuikChange II 定点诱变试剂盒，30 次反应 608.00 美元 200550 GeneMorph II 随机诱变试剂盒 1 套 566.00 美元 200552 GeneMorph II EZClone 域诱变试剂盒 1 套 425.00 美元 200555 QuikChange II-E（电穿孔）定点诱变试剂盒 10 次反应 239.00 美元 200600 DNA 提取试剂盒 1 套 371.00 美元 200820 AccuScript 高保真第一链 cDNA 合成试剂盒 1 套 359.00 美元 201115 Kb DNA Ladder 250 ug 214.00 美元 201190 鲑鱼精子 DNA 1 套 273.00 美元 201222 MiracleHyb高性能杂交溶液，250 mL 250 mL 160.00 $ 204130 GeneJammer 转染试剂，1 mL 1 mL 366.00 $
COVID-19候选疫苗在开发中，特别关注mRNA和病毒矢量平台
DNA需要进入细胞内，然后进入细胞核内。DNA需要首先转录到mRNA中，然后翻译成蛋白质抗原，以引起细胞和体液免疫反应。DNA需要越过两个膜可能需要专门的技术才能进入核（即：电穿孔）。
引文：Comer, AL、Sriran, B.、Yen, WW、Cruz-Martín, A. 一种使用双侧子宫内电穿孔来探究遗传影响的管道
随着全基因组关联研究揭示了许多神经系统疾病的异质遗传基础，研究特定基因对大脑发育和功能的贡献的需求也随之增加。依靠小鼠模型来研究特定基因操作的作用并不总是可行的，因为转基因小鼠品系非常昂贵，而且许多新的疾病相关基因还没有市售的遗传品系。此外，创建小鼠品系可能需要多年的开发和验证。子宫内电穿孔提供了一种相对快速简便的方法，可以在体内以细胞类型特异性的方式操纵基因表达，只需开发 DNA 质粒即可实现特定的基因操作。双侧子宫内电穿孔可用于靶向大量额叶皮层锥体神经元。将这种基因转移方法与行为方法相结合，可以研究基因操作对前额叶皮层网络功能以及幼鼠和成年鼠社会行为的影响。
CRISPR/Cas9 介导的猪受精卵基因组编辑前的透明带处理
Abkowitz, JL、Persik, MT、Shelton, GH、Ott, RL、Kiklevich, JV、Catlin, SN 和 Guttorp, P. (1995)。大型动物造血干细胞的行为。美国国家科学院院刊，92 (6)，2031–2035。https://doi.org/10.1073/pnas.92.6.2031 Brinkman, EK、Kousholt, AN、Harmsen, T.、Leemans, C.、Chen, T.、Jonkers, J. 和 Van Steensel, B. (2018)。模板引导的 CRISPR/Cas9 编辑的简易量化。核酸研究，46 (10)，e58。 https://doi.org/10.1093/nar/gky164 Le, QA, Hirata, M., Nguyen, NT, Takebayashi, K., Wittayarat, M., Sato, Y., Namula, Z., Nii, M., Tanihara, F., & Otoi, T. (2020)。使用不同浓度的 Cas9 蛋白和靶向肌肉生长抑制素 (MSTN) 基因的 gRNA 进行电穿孔处理对猪受精卵发育和基因编辑的影响。动物科学杂志，91 (1)，e13386。 https://doi.org/10.1111/asj.13386 Li, R.、Liu, Y.、Pedersen, HS、Kragh, PM 和 Callesen, H. (2013)。猪单性生殖胚胎去除透明带后的发育和质量。Theriogenology，80 (1)，58–64。https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2013.03.009 Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., & Gerdts, V. (2012)。猪：人类传染病的模型。微生物学趋势，20 (1)，50–57。Nishio, K., Tanihara, F., Nguyen, T.-V., Kunihara, T., Nii, M., Hirata, M., Takemoto, T., & Otoi, T. (2018)。电穿孔过程中电压强度对体外生产的猪胚胎发育和质量的影响。家畜繁殖，53 (2)，313–318。https://doi. org/10.1111/rda.13106 Peng, H., Wu, Y., & Zhang, Y. (2012)。通过电穿孔将 DNA 和吗啉代诺西酮有效递送到小鼠植入前胚胎中。PLoS One，7 (8)，e43748。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043748 Peura, TT, & Vajta, G. (2003)。绵羊和牛核移植中现有方法与新方法的比较。克隆干细胞，5 (4)，257–277。 https://doi.org/10.1089/153623003772032772 Qin, W., Dion, SL, Kutny, PM, Zhang, Y., Cheng, AW, Jillette, NL, Malhotra, A., Geurts, AM, Chen, Y.-G., & Wang, H. (2015). 通过合子电穿孔核酸酶在小鼠中实现高效的 CRISPR/Cas9 介导基因组编辑。遗传学，200 (2), 423–430。 https://doi.org/10.1534/ Genetics.115.176594 Remy, S., Chenouard, V., Tesson, L., Usal, C., Ménoret, S., Brusselle, L., Hes- lan, J.-M., Nguyen, TH, Bellien, J., Merot, J., De Cian, A., Giovannangeli, C., Concordet, J.-P., &Anegon, I. (2017). 通过使用电穿孔将 CRISPR/Cas9 蛋白和供体 DNA 递送到完整受精卵中来生成基因编辑大鼠。科学报告，7 (1)，16554。https://doi.org/10。 1038/s41598-017-16328-y Tanihara, F.、Hirata, M.、Nguyen, NT、Sawamoto, O.、Kikuchi, T.、Doi, M. 和 Otoi, T. (2020)。通过将 CRISPR/Cas9 系统电穿孔到体外受精的受精卵中有效生成 GGTA1 缺陷猪。BMC Biotechnology，20 (1)，40。https://doi.org/10.1186/s12896-020-00638-7
IPSC重新编程的自动有效解决方案
使用标准制造商的建议制备了200μm的单层细胞阵列。用1％Geltrex™涂有6孔板的单个孔和CellRaft阵列（Gibco™Cat。编号A1413301）在37°C下过夜，准备细胞播种。在电穿孔之前，将成纤维细胞培养基分配到每个井/储层中。电穿孔后立即将电穿孔的成纤维细胞重悬于1ML的成纤维细胞培养基中，然后再滴入预先涂层的6孔板和蜂窝阵列中。在第一天，成纤维细胞培养基被补充的N2B27培养基取代，该培养基补充了新鲜的基本成纤维细胞生长因子（BFGF）（Thermo Scientific Cat。编号phg0264）。从D1-D15中，使用补充新鲜BFGF的N2B27培养基每隔一天进行一次完整的培养基变化。在D16上，N2B27培养基被Essential 8™培养基取代（Gibco Cat。编号A1517001），将细胞培养为IPSC。
通向 CRISPR 工作流程的途径。
任何基因编辑实验的关键因素是成功将向导 RNA 和 Cas9 蛋白引入细胞。因此，转染、转导和电穿孔优化对于确保高编辑效率非常重要。尤其是 Cas9 转染可能是一个具有挑战性的步骤。因此，我们提供一系列稳定表达的 Cas9 细胞系来支持您的研究需求。